Tuberculosis Infection - Prevalence and Host-based Biomarkers

Introduktion
Tuberkulose (TB), hovedsageligt forårsaget af Mycobacterium tuberculosis (Mtb), er fortsat et stort globalt sundhedsproblem med anslået 10,6 millioner nye TBtilfælde om året i 2023. Verdenssundhedsorganisationen (WHO) har som mål at udrydde TB inden 2035, hvilket inkluderer håndtering af TB-infektion (TBI) i lande med lav incidensrate (IR), som Danmark. TBI er en vedvarende immunrespons på stimulering med Mtb-antigener (f.eks. målt med Interferon Gamma Release Assays (IGRA)) i fravær af kliniske tegn på TB-sygdom. Der er stadig ingen specifik standard for diagnosticering af TBI. For at kunne håndtere og reducere TBIreservoiret er det nødvendigt at bestemme den nationale TBI-prævalens og identificere specifikke interesse populationer for målrettede interventioner til at guide et dansk TB-elimineringsprogram. TB er en variabel sygdom, der primært manifesterer sig i lungerne som lunge TB, men TB kan inficere alle andre organer (TB uden for lungerene). Det kan være vanskeligt at diagnosticere TB på grund af overlappende symptomer med andre sygdomme, lav bakterie mængde og behovet for invasiv prøveudtagning til mikrobiologisk diagnose. WHO ønsker ikke-sputumbaserede biomarkør-tests for TB med høj specificitet (mål 98%) og en sensitivitet på mindst 65% i alle grupper, inklusive TB uden for lungerne. Hidtil har ingen enkelt biomarkør været i stand til at skelne mellem TB, TBI og tilstande der ligner TB (CMTB).

Mikro-RNA (miRNA) er små (18 til 25 nukleotider), enkeltstrengede, ikke-kodende RNA-molekyler, der regulerer genekspression ved at blokere translation eller spaltning af mRNA. MiRNA'er udøver deres funktioner intracellulært, men er også til stede i plasma. Værtsreaktionen på Mtb-infektion er indviklet og endnu ikke fuldt forstået, men forskellige cytokiner er involveret i kontrollen af TBI. MiRNA'er og kombinerede cytokiner kan være regulatorer af TBI og TB ved at kontrollere immunsystemet og måske fungere som markører for TB-progression og regression.

Formål med afhandlingen
Formålet var at: Artikel I) Estimere periodeprævalensen af TBI og positiv IGRA test i Danmark i 2014 baseret på TBI-screeningsdata fra patienter med inflammatorisk tarmsygdom (IBD) eller inflammatorisk reumatisk sygdom (IRD) testet med IGRA fra 2010-2018, Artikel II) Bestemme, om T-celle- og innate immunforsvar afledte cytokiner og etablerede biomarkører kan skelne 1) TB fra CMTB, 2) TB fra TBI 3) TBI fra raske kontroller (HC), Artikel III) Undersøge ændringen i 754 miRNA'er mellem TBI og TB og validere resultaterne.

Metoder
Afhandlingen er baseret på et tværsnitsregisterstudie, et prospektivt, observationelt, diagnostisk præcisionsstudie og et prospektivt, observationelt, eksplorativt kohortestudie. 

Artikel I. Baseret på landsdækkende danske registre inkluderede vi alle patienter med IBD eller IRD, som fik udført en IGRA-test mellem 2010 og 2018. Vi estimerede prævalensen af TBI og positiv IGRA test med 95% konfidensintervaller (CI) hos voksne i alderen 15-64 år efter vægtning af stikprøven (sample weighting), som justerer for skævvridninger i stikprøven fra baggrundspopulationen af køn, aldersgrupper og TB IR i fødelandet.

Artikel II. Vi brugte hæmoglobin, leukocytter, neutrofile, monocytter, C-reaktivt protein og 10 Meso Scale Discovery-analyserede cytokiner (interleukin (IL)-1β, IL2, 1L-4, IL-6, Il-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, interferon (IFN)-ɣ og tumornekrosefaktor (TNF)-α) i fuldblod stimuleret med lipopolysaccharider (LPS), zymosan (ZYM), anticluster of differentiation 3/CD28 (CD3) og ustimulerede (Null) TruCulture rør for at opfinde tre indekstests til at skelne TB fra CMTB og TBI, og TBI fra HC. Vi anvendte recursive feature elimination ved brug af en random forest model til at identificere de mest potente biomarkører.

Artikel III. Vi analyserede 754 miRNA'er ved hjælp af TaqMan™ Advanced miRNA Human A- og B-kort efter eksogen og endogen normalisering hos personer med TB og TBI. Vi anvendte recursive feature elimination ved brug af en random forest mode til at identificere de mest potente miRNA'er til at skelne TB fra TBI. Vi bestemte disse miRNA'er og ved Mann-Whitney-U-test signifikante miRNA'er (i alt 14 miRNA'er) i en valideringsgruppe fra den samme population.

Resultater
Artikel I. Hos 13.574 patienter med IBD eller IRD var 12.892 IGRA-tests (95,0 %) negative, 461 (3,4 %) var positive, og 221 (1,6 %) var inkonklusive, hvilket resulterede i en vægtet TBI-prævalens på 3,2 % (95%CI: 2,9 - 3,5) og en vægtet positiv IGRA-prævalens på 3,8% (95%CI: 3,5-4,2) blandt voksne i alderen 15-64 år i baggrundsbefolkningen i Danmark. Den uvægtede TBI-prævalens steg kraftigt med alderen og blandt personer født i lande med en TB IR på mere end 10/100.000.

Artikel II. Hos 52 personer med CMTB (n=9), TB (n=23), TBI (n=10) og HC (n=10) fandt vi, at kombinationen af LPS-IFN-ɣ, ZYM-IFN-ɣ, ZYM-TNF-α, ZYM-IL-1β, LPSIL-4, ZYM-IL-10 og neutrofile kunne differentiere TB fra CMTB med en sensitivitet på 47,8% (95 %CI: 26,8-67,7) og specificitet på 100,0% (66,4-100,0). Kombinationen af Null-IFN-ɣ, Null-IL-8, CD3-IL-6, CD3-IL-8, CD3-IL-13 og ZYM IL1b kunne skelne TB fra TBI med en sensitivitet på 73,9 % (56,5-91,3) og en specificitet på 100% (69,2-100,0). Cytokiner og etablerede biomarkører kunne ikke skelne TBI fra HC med ≥ 98 % specificitet.

Artikel III. Hos 36 personer (opdagelses gruppen) med TB (n=18) og TBI (n=18) bestemte vi 495 miRNA og fandt vi de cirkulerende miRNA'er hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-204-5p og hsa-miR-584-5p som de vigtigste til at skelne TB fra TBI. HsamiR-148a-3p og hsa-miR-204-5p var opregulerede, og hsa-miR-584-5p var nedregulerede i TB. Desuden blev 11 miRNA'er udtrykt forskelligt. I valideringsgruppen på 59 personer med TB (n=37) og TBI (n=22) viste mange af miRNA'erne det samme mønster, men foldændringerne for de 14 miRNA'er var mindre.

Konklusion
Den estimerede TBI i Danmark er lav. Vores data tyder på, at et TBeliminationsprogram bør fokusere på personer, der er født i lande med høj TB IR og som er over 44 år. Udvalgte kombinationer af cytokiner kan fungere som blodbaserede tilføjelses tests til at påvise TB i lavendemiske områder, selvom disse resultater kræver validering. Vi undersøgte cirkulerende miRNA'er for at differentiere TB fra TBI, men vi var ikke i stand til at validere resultaterne fra opdagelsesgruppen.