The roles of MFAP4 and SP-D proteins in lung cancer

SP-D protein

Baggrund: Pulmonært surfaktant protein D (SP-D) er et medfødt endogent immunprotein kendt for at hæmme cellevæksten af adenokarcinomer i lungevæv in vitro. Den pulmonære ekspression af SP-D er hæmmet signifikant i klinisk lungekræft og højere ekspression af SP-D korrelerer med en højere overlevelsesrate. Formålet med dette studie var at karakterisere variationen af SP-D i ikke-småcellet lungekræft og dets rolle heri.

 Metode: Ekspressionen af SP-D blev undersøgt i lungekræftvæv vha. TCGA databaser og immunhistokemiske farvninger. Proliferationen af lungekræftceller blev undersøgt ved både fravær og tilstedeværelse af SP-D med et WST-1 og EDU assay kits. Migrationen af lungekræftceller blev undersøgt vha. et trans-well assay. RNAsekventering blev brugt til at identificere relevante signalleringsveje. Protein-protein binding blev målt vha. ELISA og surface plasmon ræsonans (SPR) assays. Mulige signalleringsveje blev verificerede vha. western blotting. Slutteligt genererede vi en A549 cellelinje med doxycyclin-inducibelt SP-D overekspression og brugte disse til at undersøge SP-Ds rolle i tumorvækst og metastaseformation i en NOG CIEA musemodel.

Resultater: Vi validerede at den pulmonære ekspression af SP-D er nedreguleret i lungekræftpatienter. Kaplan Meier overlevelsesanalyse af lungekræftpatienter viste at patienter med lavt SP-D havde en dårligere overlevelsesprognose. WST-1 og EDU assays understøttede at behandling med rekombinant SP-D reducerede lungekræftcellers proliferation in vitro. Trans-well assay viste at migrationen af lungekræftcellelinjer var reduceret efter SP-D behandling. RNA-sekventering viste at behandling med SP-D hæmmede IL4R signalleringsvejen og vha. ELISA og SPR blev det påvist at SP-D binder IL4R alpha og derigennem hæmmer signalleringsvejen. Ydermere viste vi at overekspression af SP-D i adenokarcinom cellelinjen A549 resulterede i signifikant hæmmet tumorvækst (p-værdi = 0.007) og cellemigration in vivo

Konklusion: Vores resultater viser at SP-D hæmmer IL4R og IL13R signalleringsvejene ved at hæmme bindingen mellem IL4 og dens receptor IL4Ra og dermed hæmmer proliferation og migration af kræftceller in vitro og in vivo. Det er blevet rapporteret at IL4 øger progressionen af kræftceller vha. flere mekanismer herunder MDSCs aktivering, polarisering af makrofager til M2-associerede makrofager og hæmmer den cytotoksiske effekt af CD8+ T celler. Derfor kan lokal behandling med rekombinant SP-D være en mulig fremtidig terapi af lungekræftpatienter, da denne hæmmer IL4 og IL13 signalleringsvejene og dermed vækst og migration af lungekræftceller. 

MFAP4 protein

Baggrund: Microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4) er et ekstracellulært matrix protein udtrykt på vaskulære glatte muskelceller og fibroblaster. MFAP4 har flere funktioner herunder angiogenese, proliferation, medfødt immunforsvar og migration. En høj ekspression af MFAP4 er associeret med en dårligere prognose for patienter med lungekræft i de sene stadier. MFAP4 deltager også i celle-proliferation og -differentiering i neuroblastomer. I humane aorta vaskulære SMCs, inducerer MFAP4 celle-migration og -proliferation via FAK, PI3K og ERK signalleringsvejene. Disse effekter initieres gennem en interaktion med integrinerne αvβ3 og αvβ5. Formålet med dette studie var at undersøge hypotesen; at MFAP4 er en essentiel komponent i tumor mikromiljøet (TME) og kan inducere proliferation og migration af lungekræftceller.

 Metode: Gene Expression Omnibus (GEO) datasets blev brugt til at undersøge MFAP4 ekspressionen i forskellige typer af lungekræft cellelinjer. MFAP4 ekspressionen blev også undersøt i væv fra lungekræftpatienter vha. immunhistokemi. Ydermere, blev der lavet in situ hybridisering for at undersøge coekspressionen af MFAP4 og alpha-smooth muscle actin (a-SMA). Proliferationen af lungekræftceller med eller uden tilstedeværelse af MFAP4 blev undersøgt med WST-1 assay in vitro. Real-time PCR og ELISA blev brugt til at evaluere MFAP4 ekspressionen i normale og kræftcellelinjer. Migrationen af lungekræftceller blev evalueret med trans-well assay. Slutteligt blev RNA-sekventering brugt til at identificere relevante signalleringsveje.

Resultater: Bioinformatik, real-time PCR og ELISA viste at MFAP4 ekspressionen var significant opreguleret i småcellet lungekræftcellelinjer (SCLC), hvorimod det ikke kunne detekteres i ikke-småcellet lungekræftcellelinjer (NSCLS). In situ hybridisering understøttede at kun SCLC patienter havde MFAP4 protein ekspression. Patientprøver viste at MFAP4 er udtrykt i kræft-associerede fibroblaster; MFAP4 mRNA ekspression blev fundet i TME og overlappede med a-SMA udtryk i både SCLC og NSCLC. Derudover fandt vi at rekombinant MFAP4 inducerede lungekræftcelle proliferation og migration in vitro. Migrationen var reduceret efter anti-MFAP4 antistof behandling som blokerede MFAP4-integrin interaktionen. RNAsekventering understøttede at behandling med MFAP4 inducerede pro-onkogeniske signalleringsveje i både SCLC og NSCLC cellelinjer.

Konklusion: Vores resultater demonstrerer at MFAP4 har kapacitet til at inducere proliferation og migration af lungekræft cellelinjer in vitro, modulere kræft-relaterede signalleringsveje og kan være et muligt nyt target for fremtidig behandling af lungekræft. Vores data peger entydigt på at MFAP4 i TME er involveret i vækst og migration af lungekræft vha. integrinsignallering. Integrin αvβ3 og αvβ5 er også ibvolverede i angiogense som også har en vigtig rolle i tumorvækst. På basis af vores resultater er der behov for nye forsøg, hvor der behandles med anti-MFAP4 antistof i lungekræft modeller in vivo.