Role of urokinase plasminogen cascade for the progression of chronic kidney disease

Proteinuri er en tilstand som forekommer ved en række nyresygdomme og er karakteriseret ved at nyrerne ”lækker” protein så det kan måles i urinen. Det er en selvstændig prædiktor for forværring af nyrefunktion, øget sygelighed og død. Meget tyder på at det er proteinerne selv, der er skadelige for nyren, men mekanismen er ikke kendt. Proteiner fra koagulationssystemet, herunder plasminogen, og komplementsystemet (del af det medfødte immunforsvar) findes i urin ved defekt filtrationsbarriere, men ikke i urin fra raske. Fra in vitro studier vides, at plasmin kan aktivere og kløve de kritiske komponenter C3 og C5 i komplementsystemet. Derved dannes de proinflammatoriske molekyler C3a og C5a samt under visse omstændigheder ”membran attak” komplekser (MAC, C5b-9). Plasmin aktiveres fra inaktivt plasminogen i proteinurisk urin via urokinase-type plasminogen aktivator (uPA), som findes i urin fra raske. I studierne undersøges en række hypoteser: plasminogen og komplement filtreres sammen ved proteinuri; at aktiveret plasmin driver komplementaktivering og inflammation fra nyrernes tubulussystem; samt at dette kan forhindres helt eller delvist ved at hæmme uPA med amilorid.

Studie I undersøger udskillelsen af komplementaktiveringsprodukter i urinen hos nyretransplanterede med albuminuri som er en særlig høj-risikogruppe for tab af nyrefunktion og død og i en mindre gruppe ikke transplanterede nyresyge patienter, ligeledes med albuminuri. Endvidere undersøges ekstracellulære vesikler i urin for at lokalisere hvor henne i nyre komplement slår ned. Vi fandt at udskillelsen af splitprodukterne C3c, C3dg, og sC5b-9 associeret C9 neoantigen, normaliseret for kreatinin i spoturinprøver, var stærkt og signifikant øget ved albuminuri hos nyretransplanterede og ikke i urin fra transplanterede uden proteinuri. Samtidig sås der ikke forskelle i plasmakoncentrationer mellem de 2 grupper. Produkterne var også øget i urin fra patienter med proteinuri der ikke var transplanteret sammenlignet med raske kontroller. I ekstracellulære vesikler fra urin påvistes C9 neoantigenet kun ved albuminuri og yderligere undersøgelse via lektinaffinitetsisolering viste at både C3dg og C5b-9 var bundet til vesikler som stammede fra cellemembraner i proximale tubulus.

Studie II tager konceptet videre og undersøger en eventuel aktiveringsmekanisme via uPA-plasminogen ved eksperimenter in vitro med kommercielt tilgængelige rene komplement- og koagulations proteiner samt hvorvidt dette kunne hæmmes med amilorid. Vi undersøgte også to kohorter med patienter med albuminuri som behandles med amilorid, samt et studie med mus med inducerbar progressiv proteinuri. I proteinurisk fase blev mus behandlet med enten amilorid eller saltvandsinjektion. Vi fandt en signifikant aktivering af både C3 og C5 direkte via uPA-plasmin i buffere in vitro og i urin ex vivo. C3 og C5 aktivering kunne hæmmes på en gradueret måde ved at hæmme uPA med amilorid in vitro. C3 kunne aktiveres ved at inkubere normal rask urin ved samtidig tilsættelse af eksogent plasminogen på en amiloridfølsom måde. Patientundersøgelserne viste at en dags amiloridbehandling kun tenderede til at nedbringe C3a i urinen hos nyretransplanterede. To dages amilorid behandling i patienter med diabetisk nyresygedom og proteinuri nedsatte C3dg og C9 neoantigen udskillelse. I dyreforsøget viste vi at amilorid i 4 dage signifikant sænkede døgnudskillelsen af C3a og C5a i urinen. Specifik hæmning af uPA i 11 dage i podocin (-/-) mus med et monoklonalt hæmmende antistof der modvirkede aktivering af plasminogen medførte også en signifikant reduktion i C3a og C5a udskillelseshastighed.

I Studie III undersøges C3dg og sC5b-9 associeret C9 neoantigen i urin og plasma i konsekutive prøver opsamlet under graviditeten i en gruppe gravide med type 1 diabetes, n = 88 deltagere, hvoraf n = 14 udviklede preeklamspsi. Vi viste en signifikant stigning i både C3dg og C9 neoantigen i urinen mod slutningen af graviditeten som fulgte albuminudskillelsen hos de patienter der udviklede præeklampsi. Både C3dg og C9 neoantigen relaterede signifikant til albumin i urin men korrelationen til C9 total plasmin(ogen) var stærkere. Ekstracellulære vesikler blev også undersøgt og C3dg og C9 neoantigen blev kun påvist hos preeklampsipatienter ved gestationsuge 36, men ikke i kontroller eller ved 12 uger.

De tre studier viser at udskillelsen af aktiveringsprodukter fra komplementsystemet i urinen følger graden af proteinuri men ikke plasmakoncentrationer og at aktiveringen derfor mest sandsynligt sker i tubulussytemet efter filtrering. Endvidere kan komplement membran-attak kompleks bindes specifikt men ikke eksklusivt til proximale tubulus apikale membraner vist via ekstracellulære vesikler i urin. Korrelationen mellem komplementfaktorer til plasmin(ogen) i urin var stærkere end til albumin, foreneligt med at plasminogen kan være medvirkende til aktivering. Amilorid har in vitro en hæmmende effekt på uPA i lav mikromolærområdet, som kan eftervises in vivo i patienter med proteinuri. Den signifikante afsvækkelse men ikke fulde blokering skyldes formentlig at det findes yderligere pleiotrope aktiveringsveje som også kan drive komplementaktivering intratubulært. Resultaterne tyder på en mekanistisk kobling mellem uPAplasminogenkaskaden og komplementaktivering som alene eller sammen med andre mekanismer kan drive inflammation og vævsskade i nyrerne ved proteinuri. Dette kan også være en forklaring på hvorfor proteinuri over lang tid er associeret med fald i nyrefunktionen og kunne give ophav til nye farmakologiske mål. Amilorid og/eller stoffer med plasmin- eller komplementhæmmende effekt og som når tubulussystemet kan have en nyrebeskyttende virkning ved nyresygedom med proteinuri. Dette bør testes i fremtidige studier.