Abstract
Baggrund og hypotese
Det pro-inflammatoriske cytokin tumor nekrose factor (TNF) er kendt for at være involveret i patofysiologien af den kroniske, neuroinflammatoriske og invaliderende sygdom, multipel sklerose (MS). Patienter med MS har forhøjede værdier af TNF både i de karakteristiske, inflammatoriske læsioner og i cerebrospinalvæsken. Mod forventning blev kliniske forsøg med anti-TNF-terapi af patienter med MS afbrudt grundet symptomforværring. Påvisning af den pleiotropiske effekt af TNF, hvor opløselig og transmembran TNF medierer henholdsvis neurotoksisk effekt via TNF receptor 1 signalering og neuroprotektiv effekt via TNF receptor 2 signalering, har dog understreget betydningen af TNF i MS og vigtigheden af at forstå, hvordan produktionen af dette cytokin er reguleret. Ved at kombinere adoptiv transfer af myelinspecifikke T celler med aksonal læsion af perforant pathway, har vi vist, at infiltrerende interferon gamma (IFN-γ)- og interleukin (IL)-17-producerende, myelinspecifikke T celler stimulerer de aktiverede, TNF mRNA-udtrykkende mikroglia i områder med aksonal degeneration til at øge og protrahere deres udtryk af TNF mRNA samt igangsætte produktionen af TNF protein. Induktionen af TNF protein er ikke tidligere blevet observeret i læderede mus i fravær af T celler, hvilket indikerer, at myelinspecifikke T celler har en regulerende funktion. Vores hypotese går derfor på, at myelinspecifikke T celler påvirker den post-transkriptionelle regulering af mikroglial TNF produktion ved at regulere udtrykket af ikke-kodende RNA (ncRNA) så som mikroRNA (miRNAs), lange ikke-kodende RNA (lncRNAs) og cirkulære RNA (circRNAs), som vides at være er involveret i reguleringen af genekspression.
Metoder og resultater
Ved anvendelse af mikrogliale kulturer har vi observeret, at IFN-γ, og ikke IL-17, øger den mikrogliale ekspression af TNF mRNA og sekretion af TNF protein. For at undersøge betydningen af ncRNA i reguleringen af mikroglial TNF produktion analyserede vi RNA prøver fra IFN-γ og vehikel-stimulerede mikroglia ved hjælp af RNA sekventering. Ved brug af bioinformatik udvalgte vi 6 ncRNA kandidater med en formodet betydning for reguleringen af mikroglial TNF protein produktion: den opregulerede miR-155-5p, de nedregulerede miR-673-5p, miR-181b-5p og let-7e-5p samt den opregulerede lncRNA AW112010 og den ikke signifikant, opregulerede circRNA Ezh2. Karakterisering af det eksperimentelle materiale fra mus blev foretaget baseret på qPCR og in situ hybridisering (ISH) af TNF, CD3, IFN-γ og IL-17 mRNA udtryk og immunhistokemiske farvninger af CD11b og TNF. T celle markørerne CD3, IFN-γ og IL-17 fandtes udtrykt på mRNA niveau i læderede mus udsat for adoptiv transfer af T celler, hvilket var ledsaget af en øget mikroglial CD11b immunreaktivitet og et øget udtryk af TNF mRNA og protein i områder med aksonal degeneration. Ekspressionen af vores ncRNA kandidater blev verificeret med ISH ved brug af alkalisk fosfatase- eller Quasar-konjugerede ’locked nucleic acid’-prober. Præliminære resultater har påvist en generel T celle-afhængig forøgelse af de i forvejen højt udtrykte miRNA kandidater i områder med aksonal degeneration. CircRNA Ezh2 var ikke udtrykt under normale forhold, men blev induceret i områder med aksonal degeneration i særdeleshed under tilstedeværelse af myelinspecifikke T celler. Præliminære resultater på IFN-γ-stimulerede mikroglia behandlet med anti-miR-155-5p-konjugerede chitosan nanopartikler har ikke vist nogen effekt på den IFN-γ-inducerede sekretion af TNF i mikroglia.
Konklusion og fremtidig perspektivering
Vi har vist, at IFN-γ er ansvarlig for den øgede mikrogliale produktion af TNF in vitro, og at IFN-γ ændrer det mikrogliale transkriptom af kodende og ikke-kodende RNA. Valideringen af ekspressionen af de 6 ncRNA kandidater med en formodet betydning for den post-transkriptionelle regulering af produktionen af TNF i mikroglia er blevet påbegyndt, og præliminære resultater har vist en opregulering af miR-155-5p, miR-673-5p, miR-181b-5p, let-7e-5p og circRNA Ezh2 i områder med aksonal degeneration under tilstedeværelse af myelinspecifikke T celler. Co-lokaliseringsstudier af disse ncRNA kandidater til TNF protein-udtrykkende mikroglia i fravær og under tilstedeværelse af myelinspecifikke T celler skal fuldføres, idet co-lokalisering er en forudsætning for at de kan påvirke reguleringen af TNF specifikt i mikroglia. Afhængig af resultaterne fra disse studier og fra ekspressionsstudier udført på autopsier fra patienter med MS vil funktionen af vores ncRNA kandidater på TNF produktionen blive undersøgt ved brug af primære mikroglia behandlet med antagomir/miRNA mimic-konjugerede chitosan nanopartikler. Formålet er til stadighed at identificere TNF-specifikke ncRNA kandidater med potentiale til at blive anvendt terapeutisk i fremtidige behandlingsforløb af patienter med MS.
Det pro-inflammatoriske cytokin tumor nekrose factor (TNF) er kendt for at være involveret i patofysiologien af den kroniske, neuroinflammatoriske og invaliderende sygdom, multipel sklerose (MS). Patienter med MS har forhøjede værdier af TNF både i de karakteristiske, inflammatoriske læsioner og i cerebrospinalvæsken. Mod forventning blev kliniske forsøg med anti-TNF-terapi af patienter med MS afbrudt grundet symptomforværring. Påvisning af den pleiotropiske effekt af TNF, hvor opløselig og transmembran TNF medierer henholdsvis neurotoksisk effekt via TNF receptor 1 signalering og neuroprotektiv effekt via TNF receptor 2 signalering, har dog understreget betydningen af TNF i MS og vigtigheden af at forstå, hvordan produktionen af dette cytokin er reguleret. Ved at kombinere adoptiv transfer af myelinspecifikke T celler med aksonal læsion af perforant pathway, har vi vist, at infiltrerende interferon gamma (IFN-γ)- og interleukin (IL)-17-producerende, myelinspecifikke T celler stimulerer de aktiverede, TNF mRNA-udtrykkende mikroglia i områder med aksonal degeneration til at øge og protrahere deres udtryk af TNF mRNA samt igangsætte produktionen af TNF protein. Induktionen af TNF protein er ikke tidligere blevet observeret i læderede mus i fravær af T celler, hvilket indikerer, at myelinspecifikke T celler har en regulerende funktion. Vores hypotese går derfor på, at myelinspecifikke T celler påvirker den post-transkriptionelle regulering af mikroglial TNF produktion ved at regulere udtrykket af ikke-kodende RNA (ncRNA) så som mikroRNA (miRNAs), lange ikke-kodende RNA (lncRNAs) og cirkulære RNA (circRNAs), som vides at være er involveret i reguleringen af genekspression.
Metoder og resultater
Ved anvendelse af mikrogliale kulturer har vi observeret, at IFN-γ, og ikke IL-17, øger den mikrogliale ekspression af TNF mRNA og sekretion af TNF protein. For at undersøge betydningen af ncRNA i reguleringen af mikroglial TNF produktion analyserede vi RNA prøver fra IFN-γ og vehikel-stimulerede mikroglia ved hjælp af RNA sekventering. Ved brug af bioinformatik udvalgte vi 6 ncRNA kandidater med en formodet betydning for reguleringen af mikroglial TNF protein produktion: den opregulerede miR-155-5p, de nedregulerede miR-673-5p, miR-181b-5p og let-7e-5p samt den opregulerede lncRNA AW112010 og den ikke signifikant, opregulerede circRNA Ezh2. Karakterisering af det eksperimentelle materiale fra mus blev foretaget baseret på qPCR og in situ hybridisering (ISH) af TNF, CD3, IFN-γ og IL-17 mRNA udtryk og immunhistokemiske farvninger af CD11b og TNF. T celle markørerne CD3, IFN-γ og IL-17 fandtes udtrykt på mRNA niveau i læderede mus udsat for adoptiv transfer af T celler, hvilket var ledsaget af en øget mikroglial CD11b immunreaktivitet og et øget udtryk af TNF mRNA og protein i områder med aksonal degeneration. Ekspressionen af vores ncRNA kandidater blev verificeret med ISH ved brug af alkalisk fosfatase- eller Quasar-konjugerede ’locked nucleic acid’-prober. Præliminære resultater har påvist en generel T celle-afhængig forøgelse af de i forvejen højt udtrykte miRNA kandidater i områder med aksonal degeneration. CircRNA Ezh2 var ikke udtrykt under normale forhold, men blev induceret i områder med aksonal degeneration i særdeleshed under tilstedeværelse af myelinspecifikke T celler. Præliminære resultater på IFN-γ-stimulerede mikroglia behandlet med anti-miR-155-5p-konjugerede chitosan nanopartikler har ikke vist nogen effekt på den IFN-γ-inducerede sekretion af TNF i mikroglia.
Konklusion og fremtidig perspektivering
Vi har vist, at IFN-γ er ansvarlig for den øgede mikrogliale produktion af TNF in vitro, og at IFN-γ ændrer det mikrogliale transkriptom af kodende og ikke-kodende RNA. Valideringen af ekspressionen af de 6 ncRNA kandidater med en formodet betydning for den post-transkriptionelle regulering af produktionen af TNF i mikroglia er blevet påbegyndt, og præliminære resultater har vist en opregulering af miR-155-5p, miR-673-5p, miR-181b-5p, let-7e-5p og circRNA Ezh2 i områder med aksonal degeneration under tilstedeværelse af myelinspecifikke T celler. Co-lokaliseringsstudier af disse ncRNA kandidater til TNF protein-udtrykkende mikroglia i fravær og under tilstedeværelse af myelinspecifikke T celler skal fuldføres, idet co-lokalisering er en forudsætning for at de kan påvirke reguleringen af TNF specifikt i mikroglia. Afhængig af resultaterne fra disse studier og fra ekspressionsstudier udført på autopsier fra patienter med MS vil funktionen af vores ncRNA kandidater på TNF produktionen blive undersøgt ved brug af primære mikroglia behandlet med antagomir/miRNA mimic-konjugerede chitosan nanopartikler. Formålet er til stadighed at identificere TNF-specifikke ncRNA kandidater med potentiale til at blive anvendt terapeutisk i fremtidige behandlingsforløb af patienter med MS.
Bidragets oversatte titel | Posttranskriptionel regulering af tumor nekrose faktor og andre mikroglia-producerede cytokiner |
---|---|
Originalsprog | Engelsk |
Vejledere/rådgivere |
|
Udgiver | |
Status | Udgivet - 2020 |