Monitoring of renal transplant recipients by use of complement factors, kidney-specific cell-free DNA, Torque Teno Virus, and HLA epitope matching: Investigation and application of biomarkers in kidney transplantation: From development to clinical and research relevance

Ved terminalt nyresvigt er nyretransplantation den bedste behandling, både hvad angårsygelighed, dødelighed samt omkostningseffektivtet. Den globale efterspørgsel efternyretransplantation er stigende på grund af en tiltagende aldrende befolkning og øget forekomst afkronisk nyresygdom.

Igennem årene er både kort-, og langtidsoverlevelsen af nyreallografterne forbedret, men med en omtrentlig gennemsnitslevealder på 15-20 år for en nyregraft, er der stadig plads til forbedringer. Særligt yngre patienter har brug for, at nyregraftoverlevelsen forbedres, idet de har et langt liv foran sig ofte med behov for flere transplantationer.

Efter en nyretransplantation er immundæmpende medicin nødvendig for at undgå afstødning. Desværre har medicinen en lang række bivirkninger, og det er svært at finde den helt rigtige dosis til den enkelte patient. Hvis immunsystemet ikke er dæmpet tilstrækkeligt, kan det medføre akut og kronisk afstødning, hvilket nedsætter levetiden for nyregraften. Hvis immunsystemet til gengæld er dæmpet for meget, øges risikoen for infektioner, kræft og medicinbivirkninger. For at kunne justere medicinen nøjagtigt anvendes biomarkører. Desværre er de biomarkører, vi har til rådighed, hverken gode til at detektere afstødning eller overimmunsuppression. Mere præcise biomarkører, der afspejler patienternes immunsuppressive niveau og nyrens sundhed, er nødvendige for at optimere transplantationsforholdene og forbedre udfaldene for nyregraften og patienterne.

Formålet med afhandlingen var at undersøge og belyse udvikling, validering og anvendelsen biomarkører ved nyretransplantation. Studierne I-V repræsenterer eksempler på forskellige stadier i udvikling af biomarkører og anvendelser i forskning.

Studie I

Udvikling af et multiplex digital droplet PCR assay, som kan detektere nyrespecifikt cellefrit DNA.

I Studie I kombineres viden fra den nye biomarkør for graftskade i transplantation, donorderiveret cellefrit DNA med viden fra kræftforskningen, hvor man anvender forskelle i metyleringsmønstre i DNA til at detektere cellefrit DNA fra tumorer i blodet. Cellefrit DNA frigives til cirkulationen ved celledød eller celleskade, og mængden kan dermed bruges som en markør for celleskade og i forbindelse med nyretransplantation, for afstødning eller nyreskade.

Formålet med studiet var at udvikle en test til multiplex digital PCR, som kan detektere cellefrit DNA, der stammer fra nyren, i blodet. Testen differentierer nyrevæv fra andet væv ved hjælp af regioner i DNAet, som er forskelligt metyleret i vævene. Vi fandt fem markører, som kunne skelne nyrevæv fra andet væv ud fra databasesøgninger. Disse markører var tilstede i nyrevæv og blev kombineret i én test. Vi definerede en grænseværdi for en positiv test ved hjælp af blod fra raske personer. Testen var positiv i alle nytransplanterede og i fem ud af syv med afstødning. Selvom yderligere validering er nødvendig, så er testen lovende som klinisk værktøj, fordi den har hurtig svartid, overkommelig pris og er anvendelig hos multiorgantransplanterede.

Studie II  

Undersøgelse af komplement split produkter i plasma og urin som biomarkør for afstødning af nyreallografter.

Som en del af det medfødte immunsystem spiller komplementsystemet en afgørende rolle i immunresponset og menes at bidrage til graftskade ved nyretransplantation. Dog har meget få studier undersøgt om komplementaktivering kan måles i blod eller urin ved afstødning. Formålet med studiet var derfor at undersøge om komplementaktivering kan måles i blod og urin i forbindelse med afstødning. 

15 nyretransplanterede med afstødning blev sammenlignet med 15 uden i et case-control design. Vi målte komplementfaktorerne C3a, C3dg, C4a, and C5a i plasma og C3dg og sC5b-9 associated C9 neoantigen i urin og sammenlignede koncentrationerne ved afstødning med kontrolgruppen. Ligeledes sammenlignede vi koncentrationen i rejektionsgruppen på tidspunktet for afstødning med et tidspunkt, hvor patienterne og nyrefunktionen var stabil. 

Der var ingen signifikant forskel på C3a og C3dg i plasma mellem grupperne, men C3a og C3dg var signifikant højere i rejektionsgruppen ved afstødning, i forhold til, når patienterne var stabile. Der var ingen forskel på C4a og C5a. 

Ligeledes var der ingen forskel på grupperne i komplementudskillelsen i urin. Der var en højere udskillelse i rejektionsgruppen på tidspunktet for afstødning, end når patienterne var stabile, men dette fund var ved nærmere undersøgelse formentlig forårsaget af skade på den glomerulære filtrationsbarriere og ikke af afstødning.

Studiet konkluderer, at det kan betale sig at undersøge C3dg som biomarkør for afstødning i prospektivt og fortløbne indsamlede prøver.

Studie III  

Kinetikken af Torque Teno Virus-replikation efter nyretransplantation i en dansk kohorte af primært steroidfrie nyretransplanterede. 

Torque Teno virus (TTV) er et virus, som ikke er sygdomsfremkaldende, men som er meget udbredt i organtransplanterede. Høje TTV-niveauer i transplanterede er blevet forbundet med infektioner, mens lave niveauer er blevet associeret med afstødning. Som følge heraf er TTV blevet foreslået som en potentiel biomarkør for den overordnede immunsuppressive tilstand.

Formålet med studiet var at undersøge kinetikken af TTV efter transplantation i en kohorte af primært steroidfrie nyretransplanterede patienter i Danmark, at finde ud af om der var forskel i kinetikken og niveauet mellem børn og voksne, samt at undersøge om patienternes baselinekarakteristika influerede på TTV-niveauet.

TTV-niveauet blev undersøgt i prospektivt og fortløbende indsamlede prøver fra nyretransplanterede med en in-house PCR-test. Niveauet af TTV steg indtil tre måneder efter transplantation, hvilket stemmer overens med, hvad man har fundet i andre studier. Niveauet faldt og stabiliseredes omkring 3.5-4.0 log10 kopier/ml, hvilket var betydeligt lavere end tidligere vist i kohorter, hvor prednisolon er en del af vedligeholdelsesbehandlingen. Der var ingen forskel på TTVniveauet mellem børn og voksne, men der var en aldersrelateret sammenhæng. Recipienter over 59 år og under 6 år havde et højere TTV-niveau. Mænd havde også et højere niveau end kvinder, og der var en tendens til et højere niveau i patienter, som blev behandlet med prednisolon. 

I og med at TTV hos voksne og børn havde samme niveau og kinetik, kan det antages, at TTV også kan bruges som biomarkør hos børn. På vores transplantationscenter, transplanterer vi hovedsageligt uden brug af prednisolon. I vores studie var niveauet af TTV lavere sammenlignet med andre studier, hvor der anvendes prednisolon. Sammenholdes det lave TTV-niveau med tendens til et højere TTV niveau hos prednisolon-behandlede patienter, er der grundlag for nærmere undersøgelse af, om prednisolon har en effekt på TTV-niveauet. 

Studie IV 

Undersøgelse af associationen mellem HLA-B- og T-celle-molekylære mismatch og HLAantistoffer, afstødning samt allograft-overlevelsen i en kohorte af nyretransplanterede børn.

HLA-matchning kan potentielt forbedres ved hjælp af metoder, der kan forudsige, hvilke aminosyrer i HLA-molekylet, der udgør et epitop.

I dette studie undersøgte vi, om et bedre HLA-molekylært match kunne forbedre graftoverlevelsen, samt reducere afstødning og fremkost af HLA-antistoffer i 49 nyretransplanterede børn. Vi brugte to algoritmer, HLA-EMMA og PIRCHE-II, til at prædiktere antal af molekylære mismatch. Ved logistisk regression undersøgte vi, om der var en association mellem antal af HLA molekylære mismatch og fremkomst af de novo donorspecifikke antistoffer, HLA-antistoffer, afstødning og grafttab.

Vi fandt ingen signifikante associationer, hvilket delvist kan tilskrives det lille studie samt overraskende få udfald. Der var dog en tendens til færre de novo donorspecifikke HLA-antistoffer i patienter med en lavere PIRCHE-II score, specielt på HLA klasse II. Selvom brug af molekylær HLA-matchning ikke viste klar klinisk forbedring i vores kohorte, overvejer vi at anvende PIRCHE II som et supplerende værktøj til at vælge donor i de tilfælde, hvor recipienten har flere mulige levende donorer.

Studie V 

Effekten af reduceret immundæmpning på alloimmunitet: En retrospektiv undersøgelse af nyretransplanterede børn.

På grund af få kliniske forsøg med nyretransplanterede børn, er doseringerne af den immundæmpende medicin, der anvendes ved nyretransplantation, ekstrapoleret fra de voksne. Det er ofte nødvendigt at reducere børnenes immundæmpende behandling, hvilket øger risikoen for at inducere alloimmunitet.

Vi undersøgte derfor ændringerne i den immundæmpende behandling, årsagerne til ændringerne og den potentielle indvirkning på alloimmunitet hos 49 nyretransplanterede børn i et retrospektivt studie.

Efter et år var den immundæmpende behandling reduceret hos 72%. Dosis af mycofenolat mofetil var næsten halveret i forhold til den protokollerede. Derimod var tacrolimus velreguleret. Årsagerne til, medicinen blev reduceret var leukopeni, gastrointestinale bivirkninger og infektioner. Børn under seks år havde betydeligt flere infektioner end de ældre, mens der ikke var forskel i de gastrointestinale bivirkninger og leukopeni mellem aldersgrupperne.

De novo donorspecifikke antistoffer blev anvendt som et surrogat endepunkt, og derfor undersøgte vi, om nyrefunktionen var påvirket i de børn, som havde de novo donor-specifikke antistoffer. Vi fandt, at eGFR var signifikant reduceret hos de nyretransplanterede med de novo donor-specifikke antistoffer. Derimod havde HLA-immuniserede samme nyrefunktion som ikke HLA-immuniserede.

Selvom den immundæmpende behandling var betydeligt reduceret, var der kun 4%, der havde afstødning i løbet af første år, mens 11% udviklede de novo donor specifikke antistoffer i løbet af follow-up. 60% havde HLA-antistoffer enten før eller efter transplantationen. Patient- og graftoverlevelsen var sammenlignelig med andre opgørelser. 

Fundene indikerer, at reduktion af mycofenolat mofetil ikke medfører uacceptabel alloimmunitet, hvis dalniveauet af tacrolimus er velreguleret.