Metabolic stress through Na+-glucose cotransport (SGLT) activity promotes collectin binding, complement activation, and injury in renal proximal tubules and podocytes in diabetes

Diabetisk nefropati (DN) er en komplikation af diabetes mellitus og er karakteriseret ved vedvarende albuminuri og et progressivt fald i nyrefunktionen. DN er en af de førende årsager til nyresvigt. Natriumglukose cotransporter 2 (SGLT-2) hæmmere (glifloziner) har forbedret prognosen for nyresvigt og kardiovaskulære hændelser, men de molekylære mekanismer bag nyrebeskyttelsen er endnu ikke fuldt ud forstået. Komplementsystemet er blevet knyttet til DN og aktiveres gennem tre indbyrdes forbundne veje: den klassiske, den alternative, og lectin-vejen. Mannan-bindende lectin (MBL), et genkendelsesmolekyle af lectin-vejen, er associeret med progression og udviklingen af DN. MBL tilhører collectinfamilien, og flere collectiner er kendt: collectin lever 1 (CL-L1) og collectin nyre 1 (CL-K1). Collectiner binder til ”molekylære mønstre” på patogener, men også til ændrede selvantigener og tillader at serinproteaser (MASPs) igangsætter komplementaktiveringen. MBL og CL-L1 udtrykkes hovedsageligt i leveren, mens CL-K1 overvejende udtrykkes i nyrerne. Formålet med projektet var at udforske nye molekylære mekanismer i udviklingen af diabetes-medierede nyreskader og for at få indsigt i nyrebeskyttelsen af SGLT-2 hæmmere. Fokus for undersøgelsen var at udforske sammenhængen mellem CLK1 og DN, og måske relatere den til SGLT-2 hæmmeres beskyttende effekt. Det blev i studiet foreslået, at hyperglykæmi i tidlig diabetes fører til stress og hypoksi i SGLT-2-associerede nyreceller på grund af øget metabolisk arbejdsbyrde og iltforbrug. Cellestress og hypoksi i kombination med glykationinduceret funktion af komplementsystemet vil føre til binding af CL-K1 og resultere i komplement aktivering. SGLT-2-hæmmere sænker epithelial transport og iltforbrug og forhindrer bindingen af CL-K1 ved at reducere cellestress og derved lindre diabetes-medierede nyreskader. Derudover fokuserede vi på at identificere beskyttende signalveje i glomerulære podocytter ved en opdagelsesbaseret tilgang.

Det første studie (manuskript #1) havde til formål at undersøge, om dysreguleret diabetes med hyperglykæmi og metabolisk stressede proksimale tubulære celler er forbundet med øget syntese og frigivelse af collectiner (CL-K1 og MBL) og komplementære komponenter i lectin-vejen; for at afsløre, om SGLT-2-hæmmere dæmper disse parametre, og om deletion af CL-K1 giver beskyttelse mod diabetes-medieret nyreskade. Vi inducerede type-1 diabetes mellitus (T1DM) med streptozotocin (STZ) i FVB/NHan®Hsd og CL-K1 knockout (KO) mus og brugte en kombination af enzym-linked immunosorbent assay (ELISA), western blotting, in-situ hybridisering og real-time PCR til kvantificering af collectiner og komplementprodukter fra lectin-vejen (MBL-associeret serinprotease 1 (MASP-1), komplementfaktor 3a (C3a), komplementfaktor 5a (C5a)) i organer og plasma. Eksperimentel T1DM (14 og 35 dage) resulterede i nyreskade (øget u-albumin og KIM-1) og øget protein og mRNA-niveauer af CL-K1 og MBL-C i nyrevæv, sammen med en stigning i plasma af MASP-1. CL-K1 mRNA var lokaliseret i det juxtaglomerulære apparat og intrarenale arterier i diabetiske nyrer sammenlignet med vehikel. SGLT-2- hæmning med dapagliflozin sænkede plasma glukose og svækkede proteinmængde af CL-K1 og MBL C, men påvirkede ikke mRNA-niveauerne, eller niveauet af nyreskademarkører (KIM-1 og u-albumin) og anafylatoksiner i nyre væv. Igangværende undersøgelser af CL-K1 KO-mus kunne indikere en beskyttelse mod diabetes-medierede skader. Det konkluderes, at eksperimentel ubehandlet diabetes med hyperglykæmi øger niveauet af CL-K1 protein og mRNA, og SGLT-2-hæmmere kunne udøve beskyttelse ved at sænke niveauet af collectiner og deres binding.

Det andet studie (manuskript #2) udforskede lignende forskningsspørgsmål som i det første studie med plasmaprøver fra et klinisk interventionsforsøg. Vi antog, at SGLT-2-hæmmere sænker det cirkulerende niveau af collectiner og dæmper systemisk komplementaktivering hos patienter med type 2-diabetes mellitus (T2DM) og albuminuri. Vi analyserede parrede plasmaprøver fra et publiceret, placebokontrolleret, cross-over-interventionsstudie (DapKid-studiet) af patienter med T2DM og albuminuri behandlet med dapagliflozin og placebo i 12 uger (n=36). ELISA blev anvendt til at bestemme plasmakoncentrationen af collectiner, MASP-2, C3a og det stabile C3-splittede produkt C3dg og en neoepitop, der kun er til stede i det samlede membranangrebskompleks (sC5b-9). Vi fandt, at SGLT-2-hæmning med dapagliflozin resulterede i en let, men signifikant øget koncentration af C3a (23 %) og C3dg (9 %) i plasma. Dette var ikke forbundet med ændringer i den irkulerende koncentration af collectiner eller sC5b-9. Hypotesen om, at SGLT-2-hæmning fører til lavere niveauer af collectiner og/eller komplementaktiveringssplittede produkter i plasma blev afvist. Det kan dog ikke udelukkes at SGLT-2 hæmmere har en organspecifik lokal virkning mod komplementaktivering, som ikke afspejles systemisk.

Det tredje studie (Manuskript #3) fokuserede på effekten af SGLT-2-hæmmere på collectiner og komplementaktiveringsprodukter hos patienter med T2DM med (n=17) og uden (n=16) kronisk nyresygdom (CKD) sammenlignet med patienter med ikke-diabetisk CKD (n=16) i både plasma- og spot-urinprøver. Vi antog, at 1) CKD med og uden diabetes er forbundet med afvigende glomerulær filtration af collectiner og komplement produkter, 2) SGLT-2-hæmning med empagliflozin sænker cirkulerende collectiner og komplementaktivering i plasma, 3) SGLT-2-hæmning dæmper komplementaktivering i nyren afspejlet i urinprøver fra patienter med albuminuri og CKD. Vi analyserede parrede plasmaprøver fra et placebo-kontrolleret cross-over-interventionsstudie af patienter behandlet med empagliflozin og placebo i 4 uger (SiRENA-studiet). Vi brugte ELISA som i manuskript #2 til at bestemme niveauerne af collectiner og komplement produkter. Urin-mikrovesikler blev isoleret for at undersøge tilstedeværelsen af membranbundet C5b-9. Empagliflozin ændrede ikke collectiner (CL-K1, CL-L1 og MBL) eller komplementaktiveringssplitprodukter C3a, C5a og sC5b-9 i plasma bortset fra en stigning på 18 % i C3dgkoncentration i patienter med diabetes og CKD. Collectiner kunne ikke detekteres i spoturin eller ex vivo koncentreret urin. C3a og sC5b-9 koncentrationen i spoturin normaliseret til kreatinin faldt signifikant efter behandling med mpagliflozin i patienter med diabetes og CKD, hvilket blev genfundet i mikrovesikler fra urinen med western blotting for C5b-9. Studiet viste at SGLT-2 hæmning ikke sænker collectiner eller komplement produkter i plasma, men de reducerer signifikant komplementaktivering og membranaflejring i nyren. Langsigtet nyrebeskyttelse af SGLT-2 hæmmere kan derfor involvere reduceret komplement medieret skade.

Tilsammen understøtter disse undersøgelser hypotesen om, at CL-K1 i nyrerne kan være en patogen bidrager i de tidlige stadier af diabetisk nyrepåvirkning, og at SGLT-2-hæmmere potentielt kan udøve lokale beskyttende virkninger i nyren ved at hæmme komplementsystemet. Den nøjagtige molekylære mekanisme, hvormed CL-K1 genkender ligander, og hvor den binder, kræver yderligere undersøgelse. Ligeledes står det ikke klart præcis på hvilket niveau SGLT-2 hæmmerne beskytter.

Et fjerde studie (Manuskript #4) blev udført med en åben, ikke-hypotesedrevet tilgang for at kortlægge endogene veje, der opretholder den glomerulære filtrationsbarriere og beskytter podocytter. Podocytter er en del af den glomerulære filtrationsbarriere, og deres dysfunktion bidrager til albuminuri og DN. Vi har tidligere vist, at NPRA, receptoren for natriuretiske peptider (ANP, BNP) udtrykkes i podocytter i den menneskelige nyre og er nødvendig for at opretholde filtrationsbarriereproteiner i mus. Transgen overekspression af ANP og BNP ved infusion i mus modvirker nyreskader og DN-progression ved reduktion af albuminuri. Vi postulerede, at natriuretiske peptider udøver en direkte beskyttende effekt på integriteten af den glomerulære filtration barriere gennem aktivering af NPRA og modulering af genekspressionsmønstre i podocytter. Vi benyttede fluorescensens-assisteret cellesortering (FACS) til at isolere grønt-fluorescerende protein (GFP)-positive podocytter fra mus med konditionel, podocyt-specifik, induceret knockout af genet Npr1, der koder for NPRA. Differentielt udtrykte gener (DEGs) blev undersøgt ved RNA-sekventering af podocytter fra vildtype- og podocyt-specifikke NPRA knockout mus. Identificerede transkripter blev analyseret ved real-time PCR og ELISA af dyrkede humane og muse glomeruli. I alt blev der identificeret 158 DEGs, og blandt de nedregulerede gener var protein S, som er kendt for have en beskyttende effekt i podocytter. Resultaterne viser, at endogene niveauer af natriuretiske peptider gennem NPRA i mus understøtter beskyttende differentieringsveje i glomerulære podocytter.