Investigating MFAP4 as a novel target in vascular biology and kidney fibrosis

Matricellulære proteiner er non-strukturelle komponenter i den ekstracellulære matrix, og er vigtige for vaskulær biologi og organfibrose. Typisk modulerer de cellekommunikation og signalering, migration, proliferation, adhæsion og angiogenese. Matricellulært glycoprotein MFAP4 (Microfibrillar-Associated Protein 4, MFAP4) indeholder et RGD-bindingsmotiv i C-terminalen, hvilket gør MFAP4 til ligand for RGD-bindende integriner, især integrin αvβ3. MFAP4 er højest udtrykt i elastisk væv, såsom arterier, hvor det fremmer elastisk fiberdannelse, og dets evne til at binde integriner gør det i stand til at bidrage til aktivering af en række celletyper. Det er blevet fastslået, at serumniveauet af MFAP4 øges ved symptomatisk perifer arteriesygdom og hos patienter med kronisk nyresygdom, og at MFAP4 har potentiale til at være en diagnostisk biomarkør ved leverfibrose. Derudover er et lavt ekspressions-niveau af MFAP4 korreleret med bedre klinisk nyrefunktion. MFAP4s patofysiologiske funktion og association med hjerte-kar-sygdomme er tydelig. Denne afhandling omfatter tre separate studier, der dækker effekten af global genmangel eller terapeutisk blokering af MFAP4 i vaskulær biologi og fibrose. Til at blokere MFAP4 benyttes et antistof, der blokerer integrin-bindingen, med primær fokus på dets effektivitet ved nyrefibrose.

Studie I: MFAP4-deficiens forværrer aldersinducerede ændringer i resistensarteriestrukturen, samtidig med at hypertension sænkes

Aldring og hypertension er almindelige kardiovaskulære risikofaktorer, der fører til arteriel stivhed. MFAP4 er stærkt udtrykt i den arterielle vaskulatur som en komponent af ECM udskilt af vaskulære glatte muskelceller (VSMC) og fibroblaster. Vi satte os for at studere virkningerne af arteriel genablation ved høj alder og i Ang II-induceret arteriel hypertension. Vi brugte to-fotonmikroskopi på gamle arterier til at afdække sammensætningen, wire- og trykmyografi til at måle stivhed og VSMC-tonus i hypertension. Interessant nok viste Mfap4-deficiente gamle (20-23 måneder gamle) mesenteriske arterier højere kollagenvolumen og elastinfragmentering og derfor et reduceret forhold mellem elastin og kollagen uafhængigt af arteriel stivhed. På den anden side havde hypertensive Mfap4-deficiente mus gennemsnitligt et reduceret arterielt tryk, diastolisk tryk, mesenterisk arteriestivhed og en tendens til lavere kollagenaflejring sammenlignet med vildtype søskende fra samme kuld. Endelig var Mfap4-deficiente arterier mere effektivt kontraherende, når de blev udsat for vasokonstriktorer ex vivo, hvilket understøtter beskyttelse mod AngII-induceret arteriel stivhed. Som konklusion fandt vi, at MFAP4 bidrager til sund vaskulær aldring, men også til vaskulære ændringer forårsaget af hypertension og har potentialet til at blive brugt som et terapeutisk mål ved hypertension.

Studie II: MFAP4 øger intimal neovaskularisering og atherosclerose i ApoE-deficiente mus

Aterosklerose er en progressiv inflammatorisk lidelse karakteriseret ved ophobning af lipider i arterierne. MFAP4 udtrykkes primært af glatte muskelceller i tunica media og fremmer angiogenese ved at binde integrin αvβ3. I denne undersøgelse var hypotesen, at MFAP4 er en drivende komponent for ateroskleroseudvikling. ApoE-/- mus fodret med en Western diæt blev brugt til den aterosklerotiske model, og to studier blev udført for at undersøge virkningerne af henholdsvis Mfap4-deficiens og anti-MFAP4-behandling. Som et resultat svækkede begge modeller aterosklerotisk læsionsdannelse. Udnyttelse af proteome analyse på væv fra aortaroden i Mfap4-deficiente mus afslørede nedsat mitokondriel translation, endotelcellemigration og angiogenese. Immunfarvning med epitelmarkøren (CD31) bekræftede reduceret neovaskularisering i gen-deficiens modellen. Derudover havde intraplaque nekrose en tendens til at blive reduceret ved Mfap4-deficit og blev signifikant reduceret ved anti-MFAP4-behandling, hvilket indikerer, at inhibering af MFAP4 fører til en forbedret makromolekyle-homeostase i åreforkalkning. Vores resultater tyder på, at MFAP4-deficiens eller hæmning fører til en reduktion i intraplaque angiogenese og nedsat atherosclerose.

Studie III: Undersøgelse af MFAP4 som et nyt terapeutisk mål i nyrefibrose: indledende undersøgelse

Det er vist at global Mfap4-deficiens reducerer renal fibrose i CKD-musemodel. Her designede vi et studie for at undersøge MFAP4-ekspression i human CKD med fibrose og effektiviteten af MFAP4-blokerende terapi (anti-MFAP4-antistof) in vivo og undersøgte mulig translation til humane cellulære effekter ved hjælp af in vitro metoder. Vi undersøgte MFAP4-ekspression og aflejring i hydronefrose (n=12) og kontrolpatienter (n=12). Histologisk farvning afslørede, at MFAP4 akkumuleres i interstitielle fibrotiske aflejringer hos hydronefrosepatienter med fremskreden CKD. MFAP4 og fibrosemarkører er stærkt korrelerede på både transkriptionelt og proteinniveau i patientgruppen. Efterfølgende designede vi to studier for at teste den terapeutiske effektivitet af anti-MFAP4 behandling i musenyrefibrosemodeller. Først blev folinsyre (FA)-induceret nyrefibrose-model anvendt, og dyrene blev enten behandlet med anti-MFAP4-antistof eller vehikel. Histologisk analyse af nyrevæv viste, at den anti-MFAP4-behandlede gruppe havde signifikant mindre kollagenaflejring både 7 og 14 dage efter introduktion af FA. Derudover blev ekspression af target Mfap4 og nyretubulær skadesmarkøren Havcr1 signifikant reduceret ved anti-MFAP4 behandling. Non-biased analyse af totalt proteom viste, at FA-inducerede komplikationer blev nedsat efter anti-MFAP4-behandling. I øjeblikket bruger vi single-nuclei RNA-sekventering til at afsløre mekanismer involveret i de anti-fibrotiske virkninger. I et igangværende eksperiment fokuserer vi på en mere klinisk relevant model, hvor dyr er både diabetiske (Ins2Akita) og hypertensive (TTRhRen) og derved udvikler glomerulær skade og interstitiel fibrose. I dette forsøg behandles dyr med anti-MFAP4 eller vehikel to gange om ugen i 10 uger. Til sidst vil det ugentlige urin albumin-kreatin-forhold blive målt, og nyrerne vil blive indsamlet til yderligere analyse. Endelig viste in vitro-eksperimenter en højere aktivering af humane primære nyrefibroblaster, når de blev behandlet med MFAP4-protein, i form af øget adhæsion og migration. Virkningerne af MFAP4 in vitro kan blokeres af både anti-MFAP4 og anti-integrin αVβ3 antistoffer, hvilket tyder på, at mekanismen bag anti-fibrotisk virkning af antistoffet afhænger af en reduktion af integrin signalering.