Insight into the role of GDNF and the GDNF family of receptors in glioblastoma

Jesper Dupont Ewald*

*Kontaktforfatter

Publikation: AfhandlingPh.d.-afhandling

Abstract

Glioblastom er den mest aggressive og hyppigst forekommende type af primær hjernekræft, og på trods af behandling bestående af kirurgisk tumorfjernelse, strålebehandling og kemoterapi har glioblastompatienter en dårlig prognose med en medianoverlevelse på 15 måneder og en femårs over-levelse på 5-7 %. Det er derfor yderst vigtigt at identificere nye prognostiske faktorer og terapeutiske mål for at identificere andelen af patienter med den længste overlevelse og for at forbedre behandlingen. Den gliacelle-deriverede neurotrofiske vækstfaktor GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) er en neuronal vækstfaktor, som spiller en væsentlig rolle i neuronal udvikling og vedligehold. Der er blevet identificeret fire GDNF-familiereceptorer, GDNF-familiereceptor alfa 1-4 (GFRA1-4). RET (rearranged during transfection) receptoren er den primære co-receptor for GDNF-familien i neuronale celler. Der er tidligere blevet fundet ekspression af hhv. GDNF og GFRA1 i glioblastom-væv fra patienter, og i eksperimentelle undersøgelser har man fundet at GDNF og GFRA1 kan øge celledeling, migration, karnydannelse og øge resistens mod kemoterapi i glioblastomceller.

I studie I blev ekspressionen af GDNF, GDNF-familiereceptorerne GFRA1-4 og RET-receptoren undersøgt i glioblastomvæv fra patienter. Der blev fundet varierende niveauer af GDNF protein-ekspression i frossent tumorvæv fra 22 af de 27 undersøgte patienter, mens varierende niveauer af GDNF mRNA var til stede i alle vævene ved undersøgelse på formalin-fikseret paraffinindstøbt tumorvæv fra 10 patienter. Vi fandt høj GDNF mRNA-ekspression i GFAP-positive tumorceller og begrænset mRNA-ekspression i IBA1-positive mikroglia og makrofager og i CD34-positive endotel-celler. Receptor-immunfarvninger viste kraftig ekspression af GFRA1, begrænset ekspression af GFRA2 og meget lav ekspression af GFRA3, GFRA4 og RET. Immunfluorescens-dobbeltfarvninger viste kraftig GFRA1-ekspression i GFAP-positive tumorceller samt GFRA1 ekspression i mindre end 20 % af tumorceller positive for tumorstamcelle-markørerne OLIG2 eller SOX2. Ekspression af GFRA1 var meget lav i IBA1-positive mikroglia og makrofager og helt fraværende i CD34-positive endotelceller. Resultaterne tyder på, at GDNF hovedsageligt signalerer på en autokrin og parakrin måde målrettet GFRA1-udtrykkende tumorceller, herunder tumorstamceller, i glioblastomer. Endvidere tyder vores resultater på at GDNF-GFRA1-signalering er RET-uafhængig i glioblastomer, i det RET-ekspression var meget begrænset.

I studie II blev den prognostiske værdi af GFRA1 og GFRA2 og samtidige ekspression af henholdsvis OLIG2 og IBA1 undersøgt yderligere. En fluorescens-baseret multiplex-farvningsprotokol blev udviklet, og farvninger blev udført på en glioblastom-patientkohorte indeholdende tumorvæv fra 181 glioblastom-patienter. De fluorescens-farvede glas blev scannet og spektralt justeret digitalt, hvorefter markørerne blev klassificeret og kvantificeret. Resultaterne viste en stor variation i GFRA1-ek-spression. GFRA2-ekspression var kun til stede i tumorvæv fra en enkelt patient. En lille del af OLIG2-positive tumorstamceller udtrykte også GFRA1. Co-ekspression af GFRA1 og IBA1 var meget lav. Der var ingen sammenhæng mellem samlet overlevelse og ekspression af GFRA1 eller samtidig ekspression af GFRA1 og OLIG2. Ligeledes havde henholdsvis OLIG2 og IBA1 ikke individuel prognostisk værdi. Selvom GFRA1 ikke var associeret med overlevelsestid, blev det ofte udtrykt og kan muligvis være et mål for behandling hos glioblastom-patienter.

I studie III undersøgte vi om henholdsvis GDNF og GFRA1 har betydning for resistens mod behandling med enten kemoterapi eller stråleterapi i patient-deriverede glioblastomceller. Vi så en opregulering i mRNA-ekspressionen af GDNF og GFRA1 efter behandling med henholdsvis kemoterapi-medikamenterne temozolomid og lomustin eller bestråling. Ved hjælp af CRISPR CAS9-teknologien blev der lavet stabile transfektionsmodeller for to af cellelinjerne med knockout af enten GDNF eller GFRA1. I GDNF knockout-cellelinjerne blev cellerne sensibiliserede over for behandling med enten temozolomid eller lomustin, og eksogen tilsætning af GDNF ophævede effekten og desensibiliserede cellerne. GDNF knockout sensibiliserede ikke cellerne over for strålebehandling. Ved GFRA1 knock-out blev cellerne sensibiliserede over for behandling med enten temozolomid, lomustin eller bestråling. Resultaterne tyder på, at GDNF og GFRA1 er mediatorer af resistens over for kemoterapi, og at blokering af GDNF-GFRA1-signalering kan sensibilisere tumorcellerne over for kemoterapibehandling og strålebehandling og dermed gøre behandlingen af glioblastom-patienter mere effektiv.

Baseret på de studier, som præsenteres i denne afhandling, kan vi konkludere at GDNF og GFRA1 er bredt udtrykt i humane glioblastomer, primært i tumorceller. GDNF udtrykkes også i et lille antal mikroglia og makrofager og endotelceller, og GFRA1 udtrykkes i en undergruppe af tumorstamceller. Resultaterne peger endvidere på at GDNF-GFRA1 signaling er uafhængig af RET, da RET-ekspressionen var meget begrænset. GFRA1-ekspression var ikke associeret med overlevelse hos glioblastompatienter. Resultaterne fra det eksperimentelle studie peger i retning af at GDNF-GFRA1 spiller en rolle i resistens mod antineoplastisk behandling i glioblastomer. Yderligere belysning af mekanismerne for GDNF-GFRA1-medieret behandlingsresistens i glioblastom-tumorer kan bidrage til at udvikle mere målrettet behandling, der kan øge effektiviteten af den nuværende standardbehandling med kemoterapi og strålebehandling.
OriginalsprogEngelsk
Bevilgende institution
  • Syddansk Universitet
Vejledere/rådgivere
  • Kristensen, Bjarne Winther, Hovedvejleder
  • Meyer, Morten, Bivejleder
  • Søe, Kent, Hovedvejleder
Dato for forsvar18. dec. 2024
Udgiver
DOI
StatusUdgivet - 22. okt. 2024

Note vedr. afhandling

Afhandlingen kan læses på SDUs bibliotek.

Fingeraftryk

Dyk ned i forskningsemnerne om 'Insight into the role of GDNF and the GDNF family of receptors in glioblastoma'. Sammen danner de et unikt fingeraftryk.

Citationsformater