Abstract
Synaptisk transmission er en vigtig proces, der giver neuroner mulighed for at kommunikere med hinanden og andre celler inden for millisekunder. Depolarisering af membranen inducerer calciumtilstrømning og som følge heraf en kaskade af cellulære processer, såsom exocytose af neurotransmitterfyldte synaptiske vesikler, neurotransmitterbinding til deres respektive receptorer og endocytose af plasmamembran til generering af nye synaptiske vesikler. Dynamiske posttranslationelle modifikationer (PTM'er), såsom fosforylering, er kendt for at lette disse ultrahurtige processer. Synaptiske proteiner er imidlertid også stærkt modificeret af andre PTM'er, såsom N-bundet glykosylering og lysin acetylering. Sialyleret N-bundet glykosylering, der tilføjer en negativ ladning til proteinoverfladen, er tidligere rapporteret at spille en rolle i synapser og kan være modificeret ved neuronal aktivitet. Tilsvarende er lysin acetylering blevet knyttet til proteinaktivitet i synapsen. Ingen af disse PTM'er er imidlertid blevet undersøgt for deres dynamik i nerveterminalen efter ultrakort depolarisering og dermed deres potentielle rolle i synaptisk transmission.
Ved anvendelse af avanceret massespektrometri med høj opløsning har vi til formål at karakterisere lysin acetylering og (sialyleret) N-bundet glykosylering i isolerede rotte nerveterminaler (synaptosomer) under naive betingelser og under KCI stimuleret depolarisering i fem sekunder. Undersøgelser af acetylomet kortlagde 1594 acetyleringssteder i synaptosomer, hvoraf 296 lysin acetylerede peptider ændrede sig markant under synaptisk transmission af synaptosomer. Protein acetylering var meget afhængig af proteinlokalisering, da proteiner fra den aktive zone-berigede fraktion (0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS)-opløselige proteiner) udviste et andet acetyleringsmønster end proteiner, der var opløselige i 0,1 % SDS. Endvidere involverede ændringer i acetylomet ved synaptisk transmission overvejende metaboliske enzymer, der antyder en forbindelse mellem acetylering og reguleringen af synaptisk metabolisme i neuronal signalering.
Derudover karakteriserede vi N-bundet glykosylering i synaptosomer ved analyse af frigjorte N-glycaner, tidligere sialylerede N-bundede glykopeptider og intakte N-bundne glykopeptider. Denne analyse afslørede strukturen af 42 N-glykaner samt glykosyleringssteder fra 1965 (detekteret af deglykoproteomics / sialiomics) og 3451 unikke intakte glykopeptider. Synaptiske N-glykaner var hovedsageligt neutrale, inklusiv forskellige oligomannosesaccharider. Proteiner fra den SDS-uopløselige og SDSopløselige fraktion viste en udtalt glykan-mikroheterogenitet, der varierede mellem de to fraktioner, hvilket indikerede rumligt adskilte glykosyleringsmønstre. Ved at undersøge ændringer i forekomsten af tidligere sialylerede N-bundne glykopeptider (opnået ved titandioxidberigelse af sialylerede glykopeptider og efterfølgende deglykosylering) observerede vi, at sialylering ændrede sig på 430 glykosyleringssteder inden for fem sekunders depolarisering. Dette antyder en ny mekanisme for modulering af sialinsyrer ved plasmamembranen, da det antages, at synaptosomer mangler Golgi-apparatet. Vi diskuterede glykosylering af ionkanaler, neurotransmitterreceptorer, synaptiske vesikelproteiner og celleadhæsionsmolekyler vedrørende funktionen af N-bundet glykosylering i synapser. Ikke desto mindre har funktionen af sialyleret glykosylering brug for yderligere undersøgelse, da mange spørgsmål ikke kunne adresseres med de aktuelt tilgængelige metoder.
Generelt afspejler de beskrevne data i stor skala af det synaptiske proteom, PTMome og glykom muligvis den største globale karakterisering af synaptosomer. Vi demonstrerede for første gang, at proteinseparation ved SDS-opløselighed kan være fordelagtigt ved at afsløre rumlige forskelle i synaptosomer og påvise ændringer på proteiner i den aktive zone. Endvidere repræsenterede lysin acetylering og N-bundet glykosylering forskellige proteinundersæt, der sandsynligvis udfører forskellige funktioner under synaptisk transmission. Dette indikerer, at forskellige PTM'er i synapsen er forbundet, rumligt adskilt og meget dynamiske. Forståelsen af disse er vigtig for at fortolke hjernens funktion og symptomerne på neurodegenerative sygdomme, især i synapsen.
Ved anvendelse af avanceret massespektrometri med høj opløsning har vi til formål at karakterisere lysin acetylering og (sialyleret) N-bundet glykosylering i isolerede rotte nerveterminaler (synaptosomer) under naive betingelser og under KCI stimuleret depolarisering i fem sekunder. Undersøgelser af acetylomet kortlagde 1594 acetyleringssteder i synaptosomer, hvoraf 296 lysin acetylerede peptider ændrede sig markant under synaptisk transmission af synaptosomer. Protein acetylering var meget afhængig af proteinlokalisering, da proteiner fra den aktive zone-berigede fraktion (0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS)-opløselige proteiner) udviste et andet acetyleringsmønster end proteiner, der var opløselige i 0,1 % SDS. Endvidere involverede ændringer i acetylomet ved synaptisk transmission overvejende metaboliske enzymer, der antyder en forbindelse mellem acetylering og reguleringen af synaptisk metabolisme i neuronal signalering.
Derudover karakteriserede vi N-bundet glykosylering i synaptosomer ved analyse af frigjorte N-glycaner, tidligere sialylerede N-bundede glykopeptider og intakte N-bundne glykopeptider. Denne analyse afslørede strukturen af 42 N-glykaner samt glykosyleringssteder fra 1965 (detekteret af deglykoproteomics / sialiomics) og 3451 unikke intakte glykopeptider. Synaptiske N-glykaner var hovedsageligt neutrale, inklusiv forskellige oligomannosesaccharider. Proteiner fra den SDS-uopløselige og SDSopløselige fraktion viste en udtalt glykan-mikroheterogenitet, der varierede mellem de to fraktioner, hvilket indikerede rumligt adskilte glykosyleringsmønstre. Ved at undersøge ændringer i forekomsten af tidligere sialylerede N-bundne glykopeptider (opnået ved titandioxidberigelse af sialylerede glykopeptider og efterfølgende deglykosylering) observerede vi, at sialylering ændrede sig på 430 glykosyleringssteder inden for fem sekunders depolarisering. Dette antyder en ny mekanisme for modulering af sialinsyrer ved plasmamembranen, da det antages, at synaptosomer mangler Golgi-apparatet. Vi diskuterede glykosylering af ionkanaler, neurotransmitterreceptorer, synaptiske vesikelproteiner og celleadhæsionsmolekyler vedrørende funktionen af N-bundet glykosylering i synapser. Ikke desto mindre har funktionen af sialyleret glykosylering brug for yderligere undersøgelse, da mange spørgsmål ikke kunne adresseres med de aktuelt tilgængelige metoder.
Generelt afspejler de beskrevne data i stor skala af det synaptiske proteom, PTMome og glykom muligvis den største globale karakterisering af synaptosomer. Vi demonstrerede for første gang, at proteinseparation ved SDS-opløselighed kan være fordelagtigt ved at afsløre rumlige forskelle i synaptosomer og påvise ændringer på proteiner i den aktive zone. Endvidere repræsenterede lysin acetylering og N-bundet glykosylering forskellige proteinundersæt, der sandsynligvis udfører forskellige funktioner under synaptisk transmission. Dette indikerer, at forskellige PTM'er i synapsen er forbundet, rumligt adskilt og meget dynamiske. Forståelsen af disse er vigtig for at fortolke hjernens funktion og symptomerne på neurodegenerative sygdomme, især i synapsen.
| Originalsprog | Engelsk |
|---|---|
| Bevilgende institution |
|
| Vejledere/rådgivere |
|
| Udgiver | |
| Status | Udgivet - dec. 2019 |