Highly-Advanced LC-MS/MS analysis for increasing the safety of vaccines

En stor del af biofarmaceutika på markedet består af proteiner, der er rekombinant udtrykte og mgrundigt oprensede, for at opnå et rent og stabilt produkt. Målet med oprensningen er bland andet at fjerne biologisk materiale fra værtsorganismen, som DNA og proteiner. Værtscelleproteiner (host cell proteins, HCP) er specielt interessante, da tilstedeværelsen af disse kan igangsætte uønskede immunresponser eller sænke stabiliteten af det rekombinante protein. Den tilladte HCP mængde varierer, alt efter hvilken type protein der udtrykkes, men det er et krav at HCP indholdet skal monitoreres grundigt. Der er ikke udstedt analytiske retningslinjer for bestemmelse af HCP-mængden, men antistofbaserede metoder, som enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) har været den gyldne standard i mange år.

Avancerede væskekromatografiske systemer i kombination med massespektrometri (LC-MS), har gennem de sidste år udvist stort potentiale som en komplementær metode for HCP analyser. Udover at LC-MS ikke kræver dyre og tidskrævende antistoffer, tillader metoden diskriminering mellem de individuelle HCPer, og gør det derfor muligt at studere HCP sammensætningen og dynamikken. Det største problem man skal overkomme i LC-MS baserede HCP-analyser er det enorme dynamiske område der opstår når man analyserer lavstøkiometriske proteiner i en matrice af et enkelt protein i høj mængde. Den mest effektive metode til at overkomme dette problem er at benytte avancerede kromatografiske metoder, såsom multidimensionale separationer og systemer med høj loadingtolerance.

Målet med det præsenterede Ph.D. projekt var at udvikle en generel og robust metode til identifikation og kvantificering af HCPer ved hjælp af LC-MS. Til at evaluere arbejdet har vi brugt et biofarmaceutisk protein fra Statens Serum Institut (SSI, DK). HCP-indholdet fra dette protein har aldrig før været karakteriseret med MS, men er gennemtestet med ELISA, hvilket gør prøven optimal til validering. Vi evaluerede forskellige højtryksvæskekromatografi (HPLC) søjler, samt flere prefraktioneringsstrategier. Derudover udviklede vi en metode til hurtig og robust metode til identifikation og kvantificering af HCPer ved at bruge en kombination af dataafhængig optagelse (DDA), datauafhængig optagelse (DIA) og labelfri kvantificering. De opnåede resultater var i overensstemmelse med ELISA data. Vi udviklede en protokol til stabilisering og oprensning af billig trypsin, der giver et varmestabilt og specifikt produkt der kan bruges til fordøjelse af store mængder materiale til proteomstudier, såsom HCP- og PTMkarakterisering, med lav omkostning.