Exploring the role of kidney epithelial-derived extracellular vesicles for thedevelopment of acute kidney injury

Bidragets oversatte titel: Udforskning af nyreepitel-afledte ekstracellulære vesiklers rolle for udviklingen af akut nyreskade

Publikation: AfhandlingPh.d.-afhandling

86 Downloads (Pure)

Abstract

Akut nyreskade er karakteriseret ved et pludseligt fald af nyrefunktionen, som resulterer i forstyrrelser i væske,elektrolyt og syre-base balancen. Det er en global byrde, associeret med høj dødelighed, som rammer 7-17%af alle indlagte patienter. En potent bidrager til akut nyreskade er iskæmi-reperfusionskade, som er uundgåeligt i forbindelse med en nyretransplantation. En vigtig hændelse for udviklingen af akut nyreskade er infiltrationaf proinflammatoriske monocytter, tilkaldt af nyre epitelceller, men de præcise mekanismer bag infiltrationener endnu ukendte. Ekstracellulære vesikler (EVer) er små membranbundne vesikler, som potentielt er vigtigefor udviklingen af akut nyreskade. De bliver frigivet fra de fleste celler og er i stand til at transportere cellulærtprotein, nukleinsyrer og lipider og har vidst sig at være vigtige for kommunikation mellem celler under bådefysiologiske og patofysiologiske forhold. Det meste af vores viden om EVer kommer imidlertid fra in vitro studiereller in vivo studier, som injicerer unaturligt høje koncentrationer af EVer, og det er svært at isolere og adskillecellespecifikke EVer i blod og urin.
I min Ph.d. har jeg derfor fokuseret på at beskrive en ny transgen musemodel, udviklet i vores forskningsgruppe, som muliggør at isolere og følge Ever frigivet fra specifikke celler. Sideløbende har vi arbejdet med atidentificere mekanismer, der har indflydelse på hastigheden af frigivelsen af EVer. EVer reflekterer de celler,som frigiver dem og har derfor potentiale, som en ny nem tilgængelig ikke-invasiv biomarkør, der kan brugestil at identificere og følge udviklingen af akut nyreskade. Frigivelseshastigheden er dog meget forskellig mellemforskellige celletyper, og for at udnytte EVers fulde potentiale og bruge dem som biomarkører, må vi først opnåbedre indsigt i de mekanismer, der regulerer frigivelsen af dem.


Studie I: I det første studie har vi udviklet og karakteriseret en ny EV-reporter cellekultur og transgen musemodel, ved at bruge en afkortet version af CD9, et membranbundet EV-protein, bundet til et grønt fluorescerende protein (EGFP) uden på vesiklen. Den forkortede udgave af CD9-EGFP påvirkede ikke frigivelsen ellerstørrelsen af EVer in vitro, men kunne bruges til at isolere celle-specifikke EVer fra cellemedium ved hjælp afimmunpræcipitation. For at kunne isolere celle-specifikke EVer in vivo udviklede vi en transgen mus, der udtrykte en udgave af CD9-EGFP vendt på hovedet og flankeret af to lox P sider, hvilket resulterede i Cre recombinase afhængig ekspression af CD9-EGFP. Vi kunne derefter krydse vores transgene mus med mus,som udtrykte Cre recombinase i kardiomyocytter af hjertet, i nyreepitelceller, eller alle cellerne. Med immunpræcipitation var vi i stand til at isolere EVer fra plasma i mus, der udtrykte Cre recombinase i kardiomyocytterog alle cellerne, men ikke fra mus der udtrykte Cre recombinase i nyreepitelceller. Omvendt kunne vi isolereEVer fra mus, der udtrykte Cre recombinase i nyreepitelceller og alle cellerne i urinen, men ikke fra mus, derudtrykte det i kardiomyocytter. Det indikerer, af EVer er væske-specifikke, og at de ikke er i stand til at krydseglomerulær basalmembranen i nyren. Vores nye EV-reporter mus er et nyt værktøj, som kan bruges til at opnåny viden om EVers funktion under både fysiologiske og pathofysiologiske forhold.


Studie II: I vores andet studie brugte vi farmakologisk intervention til at efterligne hypoxi ved at stabiliserehypoxia inducible factor-1a (HIF-1a) og øge produktionen af reaktive iltarter (ROS) i mitokondriet ved at manipulere med elektrontransportkæden i vores CD9-EGFP cellekultur. Vi opsamlede cellulært vækstmedium ogkvantificerede koncentrationen af EVer ved hjælp af western blotting og nanoparticle analyze tracking metoder. Stabilisering af HIF-1a havde ingen signifikant effekt, men farmakologisk intervention, der øgede frigivelsen af ROS fra elektrontransportkæden, opregulerede frigivelsen af EVer signifikant.At ROS er vigtige for EVer sekretion, blev understøttet af at rotenon, som hæmmer tilgængeligheden af elektroner i elektrontransportkæden ved at inhibere kompleks I og TEMPO, som er en antioxidant, der mindskertilstedeværelsen af ROS, reducerede EV-sekretion. Vi testede også effekten af antimycin A, som efterlignereffekten af hypoxi ved at inhibere kompleks III in elektrontransportkæden, hvilket også resulterede i ROSafhængig opregulering af EV-sekretion. Coenzyme Q10 udveksler elektroner mellem kompleks I og III, så viblokerede syntesen af Q10 ved at inhibere et tidligt skridt af the mevalonate pathway med pitavastatin. Pitavastatin havde ingen effekt i sig selv, men den forstærkede opreguleringen af EV-sekretion, som vi så ved atopregulere tempoet af elektrontransportkæden med DCA. Når man blokerer the mevalonate pathway tidligt,påvirker det også andre komponenter, som er vigtige for EV-sekretion. Derfor brugte vi 4-nitrobenzoic acid,som specifikt blokerer dannelsen af Q10 og dermed resulterer i frigivelsen af flere elektroner og flere ROS. 4-nitrobenzoic acid opregulerede dermed også frigivelsen af EVer. Vores resultater indikerer, at ROS frigivet framitokondrierne bidrager signifikant til reguleringen af ekstracellulær EV-sekretion.


Konklusion: I det første studie demonstrerede vi en ny transgen musemodel, som muliggør isolation af cellespecifikke EVer in vivo. Derudover viste vi, at EVer er kropsvæskebetinget i kroppen, hvilket indikerer, at EVerikke krydser glomerulær basalmembranen i nyren under normale omstændigheder. I det andet studie fandt vi,at efterligning af hypoxi ved at stabilisere HIF-1a, ikke er tilstrækkeligt til at påvirke EV-sekretion. Til gengældopdagede vi at manipulation af elektrontransportkæden til at frigive flere ROS samtidig øgede EV-sekretion,hvilket bidrager til vores forståelse af de meget variable sekretionshastigheder mellem forskellige cellertyper.
Bidragets oversatte titelUdforskning af nyreepitel-afledte ekstracellulære vesiklers rolle for udviklingen af akut nyreskade
OriginalsprogEngelsk
Bevilgende institution
  • Syddansk Universitet
Vejledere/rådgivere
  • Svenningsen, Per, Hovedvejleder
  • Jensen, Boye Lagerbon, Bivejleder
  • Tepel, Martin, Bivejleder
Dato for forsvar30. jun. 2023
Udgiver
DOI
StatusUdgivet - 22. maj 2023

Fingeraftryk

Dyk ned i forskningsemnerne om 'Udforskning af nyreepitel-afledte ekstracellulære vesiklers rolle for udviklingen af akut nyreskade'. Sammen danner de et unikt fingeraftryk.

Citationsformater