Exploring Emilin1 and TNF as Novel Strategies for Abdominal Aortic Aneurysm Progression Control

Abdominal Aortic Aneurysm (AAA) er en alvorlig sundhedstilstand, hvor den abdominale aorta permanent udvides med over 50% af dens oprindelige diameter. Desværre går det ofte ubemærket hen, da AAA udvikler sig uden at forårsage symptomer, og kan føre til farlig indre blødning, der kan resultere i døden i op til 90% af tilfældene. Kirurgisk indgreb anbefales til mænd med en aortadiameter på 55 mm eller mere. Der er i øjeblikket ingen farmaceutisk behandling tilgængelig, der effektivt kan begrænse dannelse af AAA eller forhindre dens bristning, hvilket gør det vigtigt at udvikle terapeutiske muligheder for at forbedre patientresultater og livskvalitet og reducere kirurgiske procedurer. Derudover er der et stigende behov for biomarkører, der kan forudsige udvidelsen af AAA. Disse biomarkører vil hjælpe lægerne med yderligere information, når de skal beslutte, om en patient har brug for kirurgisk reparation, da beslutningen hovedsageligt er baseret på AAA-størrelsen.

Den nøjagtige årsag til AAA er ukendt, men den involverer processer som ekstracellulær matrix (ECM) proteolyse, oxidativt stress, inflammation og vaskulær glat muskelcelledød, som svækker arterievæggens fleksibilitet og modstand. AAA karakteriseres ved nedbrydning af bindevæv, især elastinfibre, pga. proteaser og et fald i elastogene proteiner som elastin-mikrofibril interfacer-placeret protein 1 (Emilin1). Emilin1, der findes i elastinrige væv, udfører elastogenese og regulering af transforming growth factor (TGF)- β. Sammenhængen mellem TGF-β og Emilin1 er forbundet med øget myogen respons og systemiske blodtryksændringer. Genetiske populationsundersøgelser afslørede en genetisk disposition for essentiel hypertension forbundet med polymorfismer i Emilin1- og/eller Tgf-β-gener. Nyere fund identificerede en variant af Emilin1-genet i en familie forbundet med aortaaneurismer, øget hudelasticitet, arthropati og bilateral perifer neuropati i nedre ekstremiteter. Desuden fører mennesker med homozygote Emilin1 funktionstabende varianter til unormal dannelse af elastin- og kollagenfibre, hvilket resulterer i arteriel tortuositet, dannelse af aortaaneurismer og knoglesårbarhed. Således placeres Emilin1 som en væsentlig mediator af normalt karvægsmorfologi, og dens funktionstab resulterer i nedsat aorta vægintegritet og abnormaltTGF-β signalering. Øget TGF-β signalering kan resultere i øget myogent respons, øget fibrose og forstyrre funktionel ECM. Dette samspil kan bidrage til en øget risiko for aneurismedannelse, hypertension og kardiovaskulære sygdomme forbundet med forhøjede TGF-β niveauer. Derfor antager vi, at opretholdelse eller øgning af Emilin1-niveauer i VSMC'er i aortavæggen mindsker AAA's ekspansionsrate, og dermed kunne Emilin1 tjene som en potentiel biomarkør for denne tilstand. I Manuskripter I og II undersøgte vi, om forøgelse af Emilin1-niveauer i aortavæggen kan begrænse AAA-vækst ved at bevare normalt blodtryk og stabilisere aortavægstrukturen.

I Manuskript I klonede og genererede vi en dobbelt-floxed omvendt kassette indeholdende musse Emilin1-EGFP, CAG-Emilin1-2A-EGFP, som faciliterer Cre-rekombinase-afhængig EGFP- og Emilin1-udtryk. Vi transfekterede succesfuldt CAG-Emilin1-2A-EGFP in i HEK293T celler og humane aorta vaskulære glatte muskelceller (HAVSMC), hvilket muliggjorde udtrykket af Emilin1 og EGFP. Vi genererede en transgen Emilin1-mus ved at indsætte CAG-Emilin1-2A-EGFP i pseudo-gravide hun mus, krydset med en han mus fra en specifik for glatte muskelceller specifik stamme (SMMHC-CreERT2 ). Desværre fandt vi gennem adskillige intensive og omhyggelige runder af karakterisering af den nye musestamme SMMHCCreERT2x Emilin1-EGFP, ingen signifikant cellespecifik stigning i niveauerne af Emilin1 eller EGFP-udtryk i aorta-væv. Derfor kunne vi ikke bekræfte funktionen af overudtrykt af Emilin1 ved aktivering af Crerekombinase ved hjælp af dyremodellen.

I Manuskript II ønskede vi at måle Emilin1 og totalt og modent TGF-β i plasma-prøver fra AAA-patienter og tilsvarende kontroller. Vi forventede, at faldende cirkulerende Emilin1 og/eller forhøjede TGF-β-niveauer kan være biomarkører for AAA-progression. Emilin-1, modent TGF-beta og total TGF-beta hos AAA-patienter (n=467) og kontroller (n=194) i den kliniske "Viborg Vascular (VIVA) Trial". Disse undersøgelser viste, at personer med AAA havde lavere Emilin1-niveauer, men højere totale TGF-β-niveauer og lavere modent TGF-β-niveauer end kontroller. Plasmaniveauer af Emilin1 korrelerede negativt med aortadiameter, hvilket indikerer, at højere Emilin1-niveauer var forbundet med mindre aortadiametre. Desuden var cirkulerende Emilin1-niveauer negativt korreleret med total TGF-β, bestemt ved en Spearman's rho på -0,127 (p=0,001). Efter justering for alder, rygning og brug af calciumantagonister, viste personer i den højeste Emilin1-tertil en 3 mm mindre basal aortadiameter sammenlignet med dem i den laveste tertil, (95% CI: -5,77 til -0,46, p=0,022). Ved anvendelse af ”competing risk” med justering for potentielle confounders var højere Emilin1-niveauer forbundet med en reduceret risiko for AAA-reparation. I AAA-human-transkriptom-datasættet (GSE57691) blev Emilin1 fundet at være signifikant forskelligt udtrykt, hvor kun den relative ekspression af Emilin1 var signifikant nedreguleret i små AAA-væv sammenlignet med kontrolvæv. Konklusionen fra den nuværende undersøgelse antyder således en korrelation mellem reducerede niveauer af Emilin1 i plasma og udviklingen af AAA'er hos mennesker. Dog er denne undersøgelse alene utilstrækkelig til definitivt at etablere en forbindelse mellem Emilin1 og reguleringen af TGF-β. Når Emilin1-niveauerne er lave, falder behovet for AAA-reparation, hvilket indikerer, at det muligvis kan fungere som en plausibel biomarkør for forudsigelse. Ikke desto mindre kræves der yderligere forskning for at validere den forudsigelige effektivitet af Emilin1 og TGF-β.

For at bekæmpe udviklingen af AAA fra mere end én vinkel rettede vi vores opmærksomhed mod den inflammatoriske respons, der driver dannelsen og progressionen af AAAs, med særligt fokus på det potente proinflammatoriske cytokin, tumor nekrose faktor (TNF). TNF frigives af forskellige celletyper som makrofager, T-lymfocytter, endotelceller og VSMCs. Oprindeligt syntetiseret TNF som en trimerisk proTNF-protein, i form af transmembran TNF (tmTNF). TmTNF gennemgår proteolytisk kløvning medieret af TNF konverterende enzym (TACE/ADAM17), hvilket frigør den opløselige form af TNF (solTNF). Både solTNF og tmTNF er biologisk aktive og binder til deres respektive receptorer, TNF-receptor 1 (TNFR1) og TNF-receptor 2 (TNFR2). Øgede TNF-niveauer påvises i AAA-patienters plasma og aneurismevægprøver, hvilket indikerer TNF's betydelige rolle i sygdomsudviklingen. I dyremodeller af AAA fører TNF-hæmning genetisk eller farmakologisk til nedsat aneurisme udvikling, hvilket reducerer udtryk af MMP-2 og MMP-9 samt makrofag infiltration. I en elastase-induceret AAA-model blev rotter behandlet med antiTNF-behandling og viste mindsket udvikling af AAA, forårsaget af reduceret makrofag infiltration og inflammation, samtidig med at ECM bevares. Ulempen ved anti-TNF-lægemidler er, at de er forbundet med alvorlige bivirkninger, såsom øget modtagelighed for infektion og demyeliniserende begivenheder. Det antages, at de negative virkninger af TNF, såsom apoptose og inflammation, er forbundet med solTNFTNFR1 signalering. På den anden side antages det, at tmTNF-TNFR2 signalering fremmer vaskulær reparation, hæmmer AAA-udvidelse og lindrer de negative virkninger forårsaget af solTNF-TNFR1 signalering. Derfor kunne selektiv hæmning af solTNF-TNFR1 signalering tilbyde en lovende behandling for dannelsen af AAA, hvilket var fokus for Manuskript III. I Manuskript III blev effektiviteten af den selektive solTNF-hæmmer, XPro1595, og den ikke-selektive TNF-hæmmer, ETN, vurderet hos mus med AAA genereret af intraluminale infusioner af pankreatisk elastase i den infrarenal regionen af aorta (PPE-model). Effekten af XPro1595 blev også evalueret hos hyperlipidæmiske apolipoprotein E (ApoE^-/-) mus med angiotensin II (ANGII) induktion. XPro1595 viste en betydelig reduktion i AAA-vækst i begge modeller, med det samme mønster set hos mus behandlet med ETN, dog ikke signifikant. Administrationen af XPro1595-terapi forbedrede elastinintegritetsscoren i aneurismevæggen i PPE AAA-modellen. Efter TNF-hæmning faldt TNFR1-niveauerne ikke signifikant, mens de histologiske lokaliteter af infiltrerende immunceller forblev uændrede. XPro1595 øgede systemiske TNF-niveauer, mens ETN øgede systemiske IL-10-niveauer, hvilket antyder, at de to behandlinger muligvis har forskellige virkninger på reguleringen af immunrespons. Disse resultater viste, at selektiv hæmning af solTNF har potentiale som en behandlingsstrategi for patienter med AAA, da det mindsker forstørrelsen af aneurismer i dyremodeller.

Selvom TNF er almindeligt kendt for sin rolle i immunregulering, har nylige studier antydet, at øgede TNFniveauer er forbundet med øget myogen respons i modstandsarterier. Det myogene respons er den automatiske sammentrækning eller afslapning af blodkarvæggene som respons på ændringer i blodtrykket for at opretholde stabil blodgennemstrømning og vævscirkulation. Et unormal myogen respons vil på lang sigt resultere i en øget vaskulær og myogen tone, hvilket kan forringe vævscirkulationen og forårsage hypertension - en betydelig risikofaktor for udviklingen af AAA. Studier, der anvender ikke-selektive TNFhæmmere som ETN, viser eliminering af myogen respons og reduktion af blodtrykket hos mus. TNF formidler myogen følsomhed primært i modstandsarterier; imidlertid beskrives det ikke, om tmTNF, solTNF eller en kombination af begge påvirker denne respons, men det antages at være påvirket af tmTNF signalering i VSMC'er. Mekanismen, hvormed tmTNF registrerer ændringer i transmuralt tryk, forbliver uklar, men involverer sandsynligvis interaktion med TNFR1 eller TNFR2, hvilket fører til konformationsændringer og omvendt signalering, der ultimativt initierer ERK-fosforylering og intracellulær calciumstigning. Da vi foreslår selektiv hæmning af SolTNF som et potentielt terapeutisk mål for dannelse og progression af AAA i manuskript III, ønskede vi at undersøge, om denne behandling også påvirkede den myogene respons og potentielt førte til effekten af blodtryk, hvilket kunne forværre forløbet for AAA-patienter. Manuskript IV havde til formål at undersøge de umiddelbare virkninger af at undertrykke solTNF specifikt sammenlignet med ikke-selektiv TNF-terapi for bedre at forstå den primære TNF-form, der påvirker vaskulær tone og, hvis det er tilfældet, om solTNF påvirker reguleringen af blodtrykket.

Trykkemyografi af mesenteriske arterier hos både han og hun C57BL/6-mus viste, at XPro1595 signifikant reducerede den myogene tone hos begge køn. Til forskel herfra demonstrerede ETN kun denne effekt hos han mus. Selvom XPro1595 påvirkede det myogene respons, påvirkede XPro1595 ikke det basale arterielle tryk hos normotensive eller ANGII-inducerede hypertensive mus eller ændrede etableret hypertension i en in vivo musmodel for blodtryk. Derudover påvirkede en to måneders behandling med XPro1595 eller ETN hos raske han mus ikke media arealet i thorakal aorta eller mesenterie arterier, hvilket understøtter blodtryksresultaterne. Disse resultater antyder, at selektiv hæmning af solTNF, såsom XPro1595, muligvis ikke påvirker reguleringen af systemisk arterielt blodtryk negativt, på trods af dens rolle i det myogene respons i mesenterie kar. Derfor bør langvarig brug af selektive SolTNF-hæmmere som XPro1595 til behandling af inflammatoriske sygdomme ikke påvirke reguleringen af systemisk arterielt blodtryk.

Afslutningsvis kaster disse studier lys over kritiske aspekter af AAA-patogenesen og terapeutiske interventioner og understreger vigtigheden af at adressere sygdommen fra flere vinkler. Emilin1 fremstår som en lovende biomarkør og terapeutisk mål for AAA, hvor TNF-hæmmere som XPro1595 viser potentiale til at reducere AAA-vækst uden at påvirke blodtrykket. Forståelsen af TNF's rolle i reguleringen af den myogene respons giver indblik i AAA-udviklingen og tilbyder veje til målrettede terapeutiske tilgange og forbedrede patientresultater.