Establishment of molecular assays for improved diagnostics of acute Lyme neuroborreliosis

Trine Andreasen Leth

Publikation: AfhandlingPh.d.-afhandling

Abstrakt

Bakterien Borrelia burgdorferi sensu lato er den ætiologiske årsag til Lyme neuroborreliose (LNB). Borrelia bakterier overføres til mennesker efter bid fra skovflåten, og kan spredes fra bidestedet i huden til andre organer, herunder nervesystemet. Lymfocytisk meningoradiculitis (Bannwarths syndrom) er en typisk manifestation af tidlig LNB, som er defineret ved stærke, udstrålende nervesmerter (radikulitis), halvsidige ansigtslammelser og lymfocytær pleocytose i cerebrospinalvæske (CSF). Det må antages som sikkert, at der er levende Borrelia bakterier i centralnervesystemet (CNS) hos patienter med LNB, da de er blevet identificeret ved PCR-analyse og dyrkning af CSF, og da penicillin virker effektivt hos patienter med symptomer på LNB. Desværre er den kliniske sensitivitet af både Borrelia dyrkning og PCR ikke tilfredsstillende høj, hvilket har ført til brugen af serologiske test. LNB diagnosticeres derfor primært på en tilstedeværelse af neurologiske symptomer, CSF pleocytose, samt påvisning af intratekalt produceret Borrelia specifikke antistoffer bestemt ud fra et beregnet CSF/serum-antistofindeks. Hos nogle patienter, med kort sygdomsvarighed, kan antistofproduktionen være meget lav og ikkepåviselig, hvilket vanskeliggør en skelnen mellem LNB og andre sygdomme i CNS. Det er derfor ønskeligt at finde supplerende metoder til at forbedrer diagnostikken af LNB, særligt i sygdommens tidlige stadie.


I denne PhD-afhandling vil jeg først give en introduktion til Borrelia burgdorferi sensu lato bakterien, og give et overblik over diagnosticeringen af LNB, samt de muligheder og udfordringer, der er knyttet dertil. Derefter vil de tre studiers formål, metoder og resultater blive gennemgået og diskuteret.


Studie I " Discriminating between Lyme neuroborreliosis and other central nervous system infections by use of biomarkers CXCL13 and IL-6"
Denne tværsnitsundersøgelse inkluderede patienter under udredning for neuroinfektioner. Mængden af CXCL13 og IL-6 i CSF blev bestemt samtidigt ved brug af et bead-baseret multiplex Bio-Plex 200 System. Patienterne blev grupperet i sikker LNB, mulig LNB, viral CNS-infektion, anden bakteriel CNS-infektion, anden CNS-sygdom (med pleocytose) og negativ (uden pleocytose) baseret på kliniske og parakliniske fund. En Principal Component Analyse (PCA) blev udført under anvendelse af resultater (CXCL13, IL-6, leukocytcelletal og proteinkoncentration) fra den laboratoriemæssige analyse af CSF.


PCA afslørede tre distinkte klynger (sikker LNB, anden bakteriel CNS-infektion og negativ (uden pleocytose) baseret på leukocytcelletal, proteinkoncentration, CXCL13- og IL-6-mængder i CSF fra 380 inkluderede patienter. Mulige LNB-tilfælde viste sig at være fordelt på tværs af forskellige klynger, med forskellige sandsynligheder for at tilhøre LNB-klyngen. En ROC-analyse indikerede en optimal CXCL13-cut-off-værdi på 50,7 pg/ml, hvilket resulterede i en sensitivitet og en specificitet på henholdsvis 93,6 og 91,1%, når man sammenlignede patienter med sikker LNB-diagnose med ikke-LNB-tilstande med CSF-pleocytose.  

Studie II " Establishment of a droplet digital PCR protocol for detection of Borrelia burgdorferi sensu lato DNA in cerebrospinal fluid " 
Studie II er en systematisk validering af en digital droplet-PCR-analyse (ddPCR), samt optimering af præanalytiske parametre til påvisning af Borrelia bakterier. Protokollen blev optimeret ved hjælp af syntetiske DNA-gBlocks og dyrkede Borrelia referencestammer. Den optimerede ddPCR-protokol blev evalueret på kliniske prøver fra patienter undersøgt for LNB (n=59). 

Den optimerede ddPCR-protokol inkluderede et centrifugeringstrin til koncentrering af prøvematerialet før DNA-oprensningen. Den analytiske følsomhed blev bestemt til at være 100 % med mindst 4 kopier af gBlocks pr. PCR og 100 %, når mere end 10 Borrelia bakterier blev tilsat 1 ml CSF. Den kliniske sensitivitet og specificitet blev beregnet til at være henholdsvis 11,1 % og 100 %.  

Studie III " Detection of Borrelia burgdorferi sensu lato DNA in cerebrospinal fluid samples followed by pre-enrichment culture " 
I denne prospektive tværsnitsundersøgelse blev voksne patienter (> 17 år), som skulle lumbalpunkteres med henblik på undersøgelse for LNB, inviteret til at deltage. CSF prøver fra patienterne blev inokuleret direkte i prøvetagningsrør indeholdende Borrelia dyrkningsmedium, som efterfølgende blev inkuberet i mindst 8 uger og undersøgt for tilstedeværelsen af Borrelia bakterier ved PCR og mikroskopi. En opformering af Borrelia bakterier blev opnået hos 23 % af patienterne med LNB, og et positivt resultat blev bekræftet af to uafhængige PCR-analysemetoder.

Konklusion 
Resultaterne fra studie I bekræfter, at CXCL13 er et værdifuldt supplement til diagnosticering af LNB, og at kombinationen af CXCL13 og IL-6 kan bruges differential diagnostisk til at evaluere patienter med mulig LNB med henblik på at underbygge den kliniske diagnose yderligere. De lave diagnostiske sensitiviteter opnået i studie II og III understøtter ikke brugen af Borrelia PCR som en rutinediagnostisk metode. Imidlertid kan præopformering af Borrelia bakterier fra CSF-prøver forbedre påvisningen af Borrelia DNA, hvilket kan vise sig at være af yderligere diagnostisk værdi hos klinisk udvalgte patienter, som undersøges i den tidlige fase af deres neuroborreliose. 
OriginalsprogEngelsk
Bevilgende institution
  • Syddansk Universitet
Vejledere/rådgivere
  • Møller, Jens Kjølseth, Hovedvejleder
  • Bek-Thomsen, Malene, Vejleder
  • Dessau, Ram Benny Christian, Vejleder
Udgiver
DOI
StatusUdgivet - 11. maj 2022

Note vedr. afhandling

Afhandlingen kan læses på SDUs bibliotek.

Fingeraftryk

Dyk ned i forskningsemnerne om 'Establishment of molecular assays for improved diagnostics of acute Lyme neuroborreliosis'. Sammen danner de et unikt fingeraftryk.

Citationsformater