Engineering of Modified Oligonucleotides for DNA Biotechnological Applications

Asmaa Abdelrahman*

*Kontaktforfatter

Publikation: AfhandlingPh.d.-afhandling

Abstract

I løbet af de sidste årtier har området for DNA-bioteknologi fået meget omtale på grund af nye revolutionerende løsninger. I denne afhandling præsenteres anvendelser af DNA-bioteknologi.

I første del anvender jeg DNA-oligonukleotider i nanoskala bruges som supramolekyler, der er konstrueret til at aggregere og dermed danne makroskalastrukturer vha. en buffer med høj ionstyrke. Jeg har arbejdet med modifikationer med hydrofob affinitet som er blevet videre funktionaliseret for at forbedre aggregeringsstabiliteten. Twisted Intercalating Nucleic Acid (TINA) monomerer blev indsat i korte sekvenser og undersøgt via nano-tracking analyse (NTA). Størrelsen af aggregaterne blev undersøgt vha. polyacrylamidgel (PAGE), og topologien af strukturerne blev visualiseret via atomic force microscope (AFM) og fluorescensmikroskop. Desuden blev biofysiske og molekylærdynamiske egenskaber undersøgt via henholdsvis cirkulær dikroisme (CD) og molekylær modellering.

I anden del bliver de modificerede ON'er brugt som en gendæmpende terapi. Antisensemodificerede oligonukleotider (ASO'er) blev designet til at målrettes mod en enkelt punktmutation, der er årsagen til en sjælden genetisk sygdom kaldet progeria. To forskellige sekvenser blev modificeret og konstrueret for sterisk at blokere det kryptiske splejsningssted, som aktiveres af mutationen, eller stopper translationen af den trunkeret version af lamin A (progerin). Det er kendt, at lamin A er en af hovedkomponenterne i den nukleære lamina, derfor ændrer det toksiske progerin kernens morfologi, hvilket resulterer i en øget stivhed af cellekernerne. Dette fører til lobuleringer, DNA-skade og forøgelse af cellekernernes kerneareal. En ny behandlingsprotokol bliver her præsenteret, hvor den modificerede ASO blev testet. Effektiviteten af de udviklede ASO'er blev evalueret ved at visualisere ændringerne i den nukleære lobulering af progeria cellerne efter gentagen behandling over 10 dage. Derudover blev genekspressionen analyseret vha. PCR.

I sidste del bliver den udviklede transfektionsprotokol anvendt til at studere effektiviteten af seks modificerede ASO-målrettede mRNA med det formål at slå progerinekspressionen ned. Til dette formål blev tre nukleotider kemisk syntetiseret via kobberkatalyseret klikreaktion indeholdende 1- phenyl-1,2,3-triazoldel sammen med to yderligere analoger substitueret med p-sulfonamid- og paminomethylgrupper til 5-positionen af 2'-O-methyluridin- eller thymidin-nukleotider. De tilsvarende phosphoramiditter blev inkorporeret i ASO'er. Denne kemiske tilsætning tillader den aromatiske stacking af phenylgruppen, hvilket reducerer den ribosomale aktivitet. Et signifikant fald i kernens areal af de behandlede celler blev visualiseret vha. konfokal mikroskopi, og nedregulering af progerin og stigning i lamin A/C-ekspression på både RNA- og proteinniveau blev observeret vha. PCR og western blot-analyser.
OriginalsprogEngelsk
Vejledere/rådgivere
  • Christensen, Eva Arnspang, Vejleder
Dato for forsvar29. maj 2024
Udgiver
DOI
StatusUdgivet - 29. apr. 2024

Note vedr. afhandling

Afhandlingen kan læses på SDUs bibliotek. 

Fingeraftryk

Dyk ned i forskningsemnerne om 'Engineering of Modified Oligonucleotides for DNA Biotechnological Applications'. Sammen danner de et unikt fingeraftryk.

Citationsformater