Development and Exploration of Extracellular Matrix Biomarkers for Steatotic Liver Disease: Industrial PhD Thesis

Baggrund: Steatotisk leversygdom (SLD) er i stigende forekomst på globalt plan. Både risikostratificering, screening af patienter og udvikling af nye lægemidler til behandling af sygdommen udgør store udfordringer. Leverbiopsi er den nuværende ’gold standard’ til vurdering af SLD og lægemiddeleffektivitet, men biopsien har flere ulemper, herunder inter- og intraobservatøruoverensstemmelse, risiko for blødning, invasivitet og heterogenitet. En måde at forbedre patientinddeling på er at finde bedre diagnostiske, farmakodynamiske og effektive ikke-invasive tests (NIT) som kan understøtte individualiseret behandling.
    Graden af leverfibrose har bedst sammenhæng med dødelighed hos patienter med SLD og er karakteriseret ved akkumulering af proteiner i den ekstracellulær matrix (ECM) i leveren. ECM består af en dybereliggende interstitiel matrix og en basalmembran, der er lokaliseret direkte under epithel- og endothelceller. Fibrillære kollagener, såsom type III kollagen, findes i den interstitielle matrix, mens kollagener, som danner en netlignende struktur, type IV og VIII, findes i basalmembranen. Ved leverskade akkumuleres proteiner, der er associerede med de to ECM-områder og danner leverfibrose.

Formål og hypotese: Den overordnede hypotese var, at blodbaserede ECM biomarkører, der måler remodelleringen af perisinusoidal- eller bro-fibrose, afspejler forskellige stadier af leverfibrosepatofysiologi. Derfor er de potentielle ikke-invasive værktøjer til at screene og overvåge patienter med SLD. Tre forskningsspørgsmål blev rejst for at teste denne hypotese: 1) Er heat shock protein 47 (HSP47), som er en chaperonin for den interstitielle type III kollagen, en potentiel ny serologisk ECM-biomarkør for svær leverfibrose hos patienter med SLD? 2) Afspejler ECM-biomarkører for perisinusoidal fibrose den tidlige patofysiologi hos patienter med SLD? 3) Kan den interstitielle matrix ECM biomarkør for type III kollagen, PRO-C3, bidrage til at forbedre de nuværende screeningsstrategier for svær leverfibrose hos patienter med SLD?
   Delmålene i afhandlingen var at 1) Udvikle og validere et nyt ELISA-assay, der måler HSP47 til vurdering af leverfibrose hos patienter med SLD, 2) Evaluere relevansen af ECM-biomarkører af perisinusoidal fibrose hos patienter med tidlig stadie af SLD, og 3) Undersøge hvorvidt ECM-biomarkører kan forbedre de nuværende screeningsstrategier for svær leverfibrose i den generelle befolkning.

Metoder: Et HSP47-C ELISA-assay blev udviklet ved hjælp af et monoklonalt antistof mod C-terminalen af HSP47. Det blev valideret på robusthed, nøjagtighed og præcision mod antigenet. Derefter blev biomarkøren evalueret i en biopsikontrolleret tværsnitsundersøgelse med 281 patienter med SLD og en historik for alkoholoverforbrug. Leverbiopsier fra SLD-populationen blev bedømt af en patolog, og serumniveauerne af HSP47-C blev sammenlignet på tværs af fibrosestadierne (0-4).
    I en tværsnitsundersøgelse blev PRO-C4 og C4M målt i 97 patienter, som dækkede forskellige sygdomsstadier, og sammenlignet med leverhistologi i patienter med tidlig eller sen SLD. I en anden kohorte blev ECM-biomarkører for perisinusoidal fibrose (PRO-C4, C4M og PRO-C8) evalueret retrospektivt i en kohorte med 70 patienter med svær overvægt og SLD med mild-til-moderat fibrose (F0-2), der gennemgik bariatrisk kirurgi. Blodprøver blev indsamlet på operationstidspunktet og tre, seks og 12 måneder efter operationen. 40 patienter fik lavet en ekstra biopsi ved 12-måneders opfølgningen. Biomarkørniveauerne blev analyseret ved baseline såvel som longitudinelt for at vurdere behandlingsinducerede ændringer
    Endelig blev ADAPT-scoren, som er baseret på type III kollagen formationsmarkøren PRO-C3, inkluderet i en screeningsstrategi for SLD i den generelle befolkning. 5860 patienter med tilgængelig måling af lever stivhed (LSM) blev inkluderet i analysen. Patienter med LSM≥8 kPa blev inviteret til en leverbiopsi. Vi sammenlignede screeningsstrategier ved brug af den almindeligt anvendte FIB-4, ADAPT alene eller i sekvens for at finde patienter med svær fibrose (F≥3). I en subgruppeanalyse blev ADAPT sammenlignet med en anden direkte markør for fibrosedannelse, enhanched liver fibrosis (ELF)-score. Derudover blev de to scorer kombineret som en parallel screeningstest.

Resultater: Et ELISA-assay blev succesfuldt udviklet til HSP47-C og valideret til at være robust, præcist og nøjagtigt uden interferens fra almindelige serumproteiner. Medianen af HSP47-C øgedes med stigende sværhedsgrad af leverfibrose-stadie. Den kunne adskille patienter med mild-til-moderat fibrose (F0-2) fra patienter med svær fibrose (F3-4) med et areal under en receiver operating characteristic curve på 0.72.
   I tværsnitsundersøgelsen steg PRO-C4 og C4M med non-alcoholic fatty liver activity score (NAS), men kun hos patienter med tidlig SLD. Hos patienter som fik udført bariatrisk kirurgi, faldt ECM-biomarkørerne for perisinusoidal fibrose, PRO-C4, C4M og PRO-C8 signifikant efter operationen, mens ECM interstitiel matrix-markøren, PRO-C3, forblev stabil.
    Sekventiel brug af FIB-4 og ADAPT øgede den positive prædiktive værdi og henvisninger til det sekundære sundhedsvæsen. Subgruppeanalysen viste, at parallel brug af ADAPT og ELF efter FIB-4 reducerede antallet af unødvendige henvisninger fra det primære til sekundære sundhedsvæsen med 80%, og hvor kun ét tilfælde af svær fibrose blev overset.

Konklusion: ECM-biomarkører som måler forskellige ECM-processer afspejler forskellige aspekter af SLD. ECM-biomarkører for basalmembran-remodellering afspejler tidlig patofysiologi i SLD, mens biomarkører forbundet med ændringer i den interstitielle matrix og fibrillære kollagener er forhøjede ved svær sygdom. Disse direkte biomarkører for svær fibrose kan potentielt anvendes klinisk til at forbedre screeningsstrategier for SLD i den generelle befolkning med risikofaktorer.