Characterization of the immune microenvironment in gliomas and its potential clinical value

Publikation: AfhandlingPh.d.-afhandling

16 Downloads (Pure)

Abstract

Den hyppigst forekommende maligne primære hjernetumor er diffust gliom. Hvert år bliver omkring 600voksne danskere diagnosticeret med diffust gliom. Diffuse gliomer inddeles i malignitetsgrad II-IV ud fraVerdenssundhedsorganisationens (WHO) retningslinjer, og klassifikationen er baseret på histomolekylærekarakteristika. Glioblastomet, grad IV, er den hyppigste og mest aggressive type af diffust gliom. Glioblastomer en af de mest dødelige kræftformer. Kun 5-10% af patienterne med glioblastom er i live 5 år efterdiagnosetidspunktet trods behandling med resektion, stråle- og kemoterapi. Glioblastomer er megetheterogene, og flere subtyper og subpopulationer af celler eksisterer både i den samme tumor og mellemforskellige tumorer, hvilket vanskeliggør målrettet kræftbehandling. Nogle af disse subtyper ogsubpopulationer er kendetegnet ved at være særligt aggressive og modstandsdygtige over for behandling. Indtilfor nyligt har de fleste behandlingsstrategier fokuseret på selve tumorcellerne, men adskilligeforskningsresultater gennem de sidste årtier har vist, at særligt immuncellerne i tumorens mikromiljø fremmerprogression af kræft. Dette har medført, at immunterapi fx immun-checkpoint hæmmere indgår som en del afkræftbehandlingsstrategien.Vævsundersøgelser har vist, at tumor-associerede mikroglia/makrofager (TAMs) er den dominerende typeaf immunceller i gliomer. Ud af deres aktiveringsstatus kategoriseres TAMs oftest som 1) tumor-hæmmendeog pro-inflammatorisk (M1 fænotype) eller 2) tumor-fremmende og immunsupprimerende (M2 fænotype).Scavenger-receptoren CD204 er en relativt ny markør for M2-polariserede TAMs, og ifølge flere studier erCD204 forbundet med en dårlig prognose i mange kræftformer inklusiv diffust gliom. CD204 kunne derforvære et fremtidigt mål for kræftbehandling, men yderligere forskning er påkrævet for bl.a. at afdække densuafhængige prognostiske værdi. Indtil videre har patienter med glioblastom haft sparsom effekt afimmunterapi, hvilket kan skyldes dets immunsupprimerende mikromiljø med få T-celler og svækketimmunogenicitet pga. lavt udtryk af neoantigener. Det hyppigst forekommende neoantigen i diffust gliom ermuteret isocitrat dehydrogenase (IDH). Nyere forskning indikerer, at IDH-mutationer og dens onkometabolitD-2-hydroxyglutarat undertrykker immun-mikromiljøet i gliomer. Det overordnede formål med denne PhDafhandling var at karakterisere immun-landskabet i gliom med to primære fokuspunkter: 1) den kliniske værdiaf CD204+ TAMs i glioblastom og 2) IDH-mutationers betydning for immun-mikromiljøet i diffust gliom.I manuskript I undersøgte vi den prognostiske værdi af TAMs og CD204+ TAMs i gliomer. Vævsprøverfra 240 gliompatienter blev analyseret ved dobbelt immunfluorescens-farvninger med antistoffer rettet modionized calcium-binding adaptor molecule-1 (IBA1) og CD204 for at detektere hhv. alle TAMs og M2-polariserede TAMs. En pixel-baseret algoritme blev udviklet til at kvantificere niveauet af de individuellemarkører og deres koekspression. Resultaterne viste, at udtrykket af både IBA1 og CD204 steg medmalignitetsgraden. CD204 havde en uafhængig prognostisk værdi i grad III-IV gliomer og var associeret medkortere overlevelsestid. Omvendt var høj IBA1 intensitet associeret med en bedre prognose. TAMs varheterogent fordelt i gliomer på et intra- og intertumoralt niveau og ophobede sig især centralt i tumorvævet.CD204+ TAMs var dog også tilstede i invasionszone og har derfor en mulig betydning for tumorens evne til atmigrere og invadere. Tætheden af TAMs var særligt høj i perivaskulære og perinekrotiske områder, hvor glioblastomceller med stamcelle egenskaber er kendt for at opholde sig. Nekrotiske områder viste sig også atvære mere udpræget i glioblastomer med højt CD204 udtryk. Vi undersøgte derfor, om der var en interaktionmellem TAMs og glioblastomceller med stamcelle egenskaber vha. dobbelt immunhistokemiske farvningermed antistoffer rettet mod IBA1, CD204 og et panel af stamcelle-relaterede markører bl.a. podoplanin ogCD133. Vi observerede, at navnligt podoplanin+ glioblastomceller og CD204+ TAMs var i tæt kontakt medhinanden i perinekrotiske områder. Vi subtypebestemte en gliomkohorte vha. immunohistokemi ogobserverede, at især andelen af CD204+ TAMs var signifikant højere i tumorer med den aggressivemesenkymale fænotype. Immunfluorescens-baseret subtypering viste, at CD204+ TAMs udtrykte både M1- ogM2-relaterede proteiner samt tumor-faciliterende proteiner. Vores resultater tyder således på, at CD204+ TAMsfremmer tumor progression ved at inducere en aggressiv og invasiv subtype af gliom/glioblastom.I manuskript II udforskede vi den mulige biologiske betydning af CD204 nærmere vha. myeloidtranskriptom-profilering på en selekteret glioblastom-kohorte. Denne profilering afslørede, at glioblastomermed højt CD204 udtryk havde en unik signatur med opregulering af gener relateret til hypoksi, angiogeneseog invasion. Blandt disse gener var interleukin-6, interleukin-8, programmed death-ligand 1, podoplanin ogCD44. Gen-signaturen var associeret med dårlig prognose, men var ikke en stærkere prognostisk markør endCD204. Klynge- og netværksanalyser af de opregulerede gener afslørede, at interleukin-6 formede et epicenterog havde det højeste antal gen-gen-interaktioner. Pathway-analyser demonstrerede en overrepræsentation oftermer relateret til fx immunaktivering og ekstracellulær matrix organisering herunder tumor necrosis factor(TNF) and interferon signaleringsvejene.I manuskript III undersøgte vi, om IDH-mutation og D-2-hydroxyglutarat havde en indvirkning på detmedfødte og adaptive immunsystem i diffust gliom. Vi analyserede niveauet af komplement aflejring og Tcelle infiltration ved at lave immunhistokemiske farvninger på en patientkohorte bestående af 72 astrocytæregliomer, grad III-IV, som var stratificeret ud fra IDH-mutationsstatus. Analyserne viste, at IDH-muteredetumorer havde signifikant mindre aflejret komplement samt færre CD4+ T-hjælpeceller, CD8+ cytotoksiske Tceller og forkhead box P3+ regulatoriske T-celler ift. IDH-vildtype tumorer. Ex vivo eksperimenter med D-2-hydroxyglutarat demonstrerede, at D-2-hydroxyglutarat hæmmede komplement-medieret destruktion af bådeerytrocytter og en glioblastom-cellelinje ved at hindre cellelysering og opsonin-medieret fagocytose. D-2-hydroxyglutarat influerede derimod ikke dendritcellers evne til at differentiere eller præsentere antigen. D-2-hydroxyglutarat svækkede T-hjælpecellers proliferation, cytokin sekretion og migration samt cytotoksiske Tcellers migration. Eksponering for D-2-hydroxyglutarat stimulerede differentiering af regulatoriske T-celler,men hæmmede samtidig de regulatoriske T-cellers evne til at proliferere og secernere interleukin-10.I manuskript IV undersøgte vi sammenhængen mellem IDH-mutation og forekomsten af de inhibitoriskeimmun-checkpoint proteiner galectin-9 og/eller T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3(TIM3). Vi implementerede en 3-plex kromogen immunhistokemisk protokol bestående af antistoffer rettetmod galectin-9, TIM3 og tumor-markøren oligodendrocyte transcription factor 2 (OLIG2) og brugteprotokollen til at farve vævsprøver fra den etablerede patientkohorte, som er beskrevet ovenfor. Farvningenblev kvantificeret ved brug af celletælling og stereologiske principper. Data viste, at antallet af TIM3+ cellervar signifikant lavere i IDH-muterede tumorer sammenlignet med IDH-vildtype tumorer. Derimod så vi ingen signifikant forskel i antallet af galectin-9+ celler. Dobbelt immunfluorescens-farvninger demonstrerede, athovedparten af de TIM3+ og galectin-9+ celler var IBA1+ TAMs. OLIG2+ tumorceller udgjorde ~45-50% afalle celler i både IDH-muterede og IDH-vildtype tumorer, og disse tumorceller udtrykte kun undtagelsesvistgalectin-9 og TIM3. Forekomsten af TIM3+ galectin-9- var lav, og morfologisk lignede disse celler TAMs ellerT-celler. Dobbelt immunfluorescens-farvninger fastslog, at TIM3 blev udtrykt af kun ~10% af CD3+ T-celler.IDH-muterede tumorer havde færre TIM3+ T-celler, og kun 50% af disse T-celler interagerede med galectin9+ TAMs. Derimod blev en ~85-100% interaktionsrate påvist i IDH-vildtype tumorer. Stort set ingeninteraktion blev observeret mellem TIM3+ T-celler og OLIG2+ tumorceller. Ved brug af et in silico datasætpåviste vi, at 75 gener var differentielt opreguleret i glioblastomer med den højeste TIM3 ekspressionsammenlignet med glioblastomer med den laveste TIM3 ekspression. Ingen gener var differentieltnedreguleret. Størstedelen af de opregulerede gener var associeret med regulering og kemotaksi af leukocytter.CD204 og interleukin-6 var blandt de opregulerede gener, og deres ekspressionsnivauer var signifikant laverei IDH-muterede astrocytære gliomer. Pathway-analyser viste, at de opregulerede gener bl.a. var involveret iTNF, komplement og fagosom signaleringsvejene.Samlet set viser resultaterne i denne afhandling, at den prognostiske værdi af TAMs afhænger af deresfænotype frem for det samlede antal af TAMs, idet kun CD204+ TAMs korrelerede med en dårlig prognosehos patienter med grad III-IV gliom. Karakterisering af CD204+ TAMs og glioblastomer med højt CD204udtryk demonstrerede, at CD204 er associeret med et inflammeret og immunsupprimerende tumor-mikromiljø,som har en høj ekspression af multiple tumor-fremmende faktorer herunder interleukin-6. En lovendeimmunterapeutisk strategi kunne derfor være hæmning af CD204 og/eller interleukin-6 med det formål atreprogrammere TAMs til en tumor-bekæmpende fænotype og øge effekten af standard kræftbehandling inkl.immunterapi. Vores resultater understøtter ideen om, at IDH-mutationer inducerer en globalimmunsuppression i diffuse gliomer, som påvirker det medfødte og adaptive immunsystem samt immuncheckpoint signalering. Dette fund indikerer, at forskere og klinikere bør tage højde for IDH-mutationsstatus,når immunterapi overvejes som en behandlingsform. Muteret IDH kunne ligeledes være et attraktivtimmunterapeutisk mål i sig selv, og kombinationsbehandling med fx immun-checkpoint hæmmere sammenmutationsspecifikke IDH-inhibitorer/vacciner kunne være klinisk relevant.
OriginalsprogDansk
Bevilgende institution
  • Syddansk Universitet
Vejledere/rådgivere
  • Kristensen, Bjarne Winther, Hovedvejleder
  • Finsen, Bente, Vejleder
  • Lambertsen, Kate Lykke, Vejleder
  • Lathia, Justin D, Vejleder, Ekstern person
Dato for forsvar4. maj 2023
Udgiver
DOI
StatusUdgivet - 21. apr. 2023

Citationsformater